1、（Fluorescence in situ hybridization,FISH）主講：張奎學院：生物技術(shù)學院學號：222007331212003原位雜交（原位雜交（ISH）v原位雜交 (in situ hybridization, ISH) 將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交。v原位雜交技術(shù)(ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀60年代。v使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。基本原理基本原理v根據(jù)堿基互補配對原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。

2、用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DAN 的存在與定位。v3H、35S、125I、32P等 放射性同位素12熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)2v同位素原位雜交的不足之處：v1、不穩(wěn)定v2、高背景v3、曝光時間長v4、結(jié)果統(tǒng)計處理繁瑣v5、同位素的使用和處理幾種原位雜交技術(shù)幾種原位雜交技術(shù)v1 基因組原位雜交技術(shù)v2 熒光原位雜交技術(shù)v3 多彩色熒光原位雜交技術(shù)v4 原位PCR熒光原位雜交熒光原位雜交v熒光原位雜交（Fluor

3、escence in situ hybridization， FISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù),以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料。FISH的基本原理的基本原理vFISH基本原理是利用同源互補的待檢染色體與用生物素、地高辛標記過的核酸探針,經(jīng)變性- 退火- 復性,形成待檢DNA與核酸探針的雜交體。使探針與熒光素標記的特異親和素之間發(fā)生免疫化學反應,最后用熒光顯微鏡對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析

4、。發(fā)展歷史發(fā)展歷史v1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應用，提高了定位的準確性。v20世紀70年代后期人們開始探討熒光標記的原位雜交，即FISH技術(shù)。v1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上，標志著染色體定位技術(shù)取得了重要進展。v1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素標記的核酸探針對DNA進行了雜交,開創(chuàng)了RNA-DNA 的同位素原位雜交技術(shù)。v他們都是采用放射性同位素標記探針,需要采用放射自顯影進行檢測,這種檢測上的限制及當時分子克隆方法的缺乏使得DNA原位雜交技術(shù)不能很快得到廣泛應用。v1974 年

5、，Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來,提高了基因定位的準確性。v1975 年,Manning 等最先在溶液的分子雜交中,使用非放射性標記,通過細胞色素C 將生物素與RNA 分子連接起來。v1977 年Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測目的DNA 的非同位素原位雜交(NISH)。v1981 年，Langer 等首次采用生物素標記的核苷酸探針成功地進行了染色體原位雜交,建立了非放射性原位雜交技術(shù) 。至此,以熒光標記的探針在細胞制片上進行基因原位雜交的技術(shù)建立起來。v1985 年，原位雜交技術(shù)被引進到植物。v1986 年，Cremer 與Licher 等分別證實了熒光原位雜交

6、技術(shù)應用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性,從而開辟了間期細胞遺傳學研究。v20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的進行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應用。FISH樣本的樣本的制備制備探針的制備探針的制備探針標記探針標記雜雜 交交（染色體顯帶）（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測熒光顯微鏡檢測結(jié)果分析結(jié)果分析DNARNAPNA將探針置于載玻片上雜交加蓋玻片變性檢測在熒光顯微鏡下觀察探針的制備v探針（probe)是指用于檢測特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達的DNA、RNA或寡核苷酸序列。v雜交實驗所選擇的核酸探針可以分為三種：化學合成、克隆和PCR。探針的分類探針的分

7、類v根據(jù)化學組成，可以將探針分為DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探針。vDNA探針 這類探針應用最廣，可以通過化學合成、克隆或PCR技術(shù)獲得。vRNA探針 一般用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄克隆的DNA序列獲得。RNA-RNA雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA探針容易被RNase降解。v肽核苷酸（PNA）探針 PNA寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺）。PNA與DNA雜交時也遵循堿基互補配對原則v與DNA相比，PNA對熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強度，因此雜交時，受探針變性溫度和溶液PH的影響較小，鑒于這些特點和優(yōu)

8、點，PNA有望取代DNA或RNA作為FISH的探針。但由于PNA探針只能通過化學方法進行合成，而且合成費用高，因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒和泛端粒探針。v寡核苷酸探針 它是根據(jù)探針靶序列的堿基順序用化學方法合成的單鏈DNA，其長度為15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易滲透到細胞的目標區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團或報告分子數(shù)目，并最終導致雜交后熒光信號較弱。因此這類探針僅實用于對重復單位較短的高度重復序列的熒光原位雜交分析。探針標記探針標記v為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。v熒光原位雜交

9、得探針常用熒光素或地高辛進行標記。v探針標記可以采用均勻標記和末端標記的方法。v對探針進行標記時，可復制合成一段新探針分子，在復制合成過程滲入標記核苷酸，從而使整個新分子被均勻地標記。其顯著的特點是標記不局限一個位點，而是均勻地滲入，探針的信號強。v均勻標記有切口平移法、隨機引物法和PCR擴增等方法。均勻標記均勻標記 切口平移法可對環(huán)狀或線性雙鏈DNA進行標記。一般對克隆的DNA片段用這種方法標記的效果較好。 該方法使用時應注意： A.只能標記雙鏈DNA 使用探針時要預先變性后再使用，而且標記時DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合適 太多會將DNA模板切碎，不能進行標記反應；太少則不

10、能有效地打開缺口，使標記物不能進入缺口 C. 標記時間不能太短 太短時間會造成標記量不足，影響雜交的進行 v1、不但可用于雙連DNA的標記，而且可用于單連DNA和RNA的標記v2、操作簡單v3、標記率高末端標記末端標記v直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加上標記的原子或復合物，這種直接標記一般是在探針分子的末端進行，所以稱之為末端標記。v經(jīng)過末端標記的核酸分子除作為雜交探針外，更多的用于RNA S1作圖以及引物延伸反應中的標記引物。染色體顯帶染色體顯帶v顯帶染色是將染色體經(jīng)過一定程序的處理,并用特定的染料染色后,使染色體在其長軸上顯示出一個個明暗交替或深淺不同的

11、橫紋,這樣的橫紋就叫做染色體的帶。食管癌細胞系24色染色體mFISH核型分析v每條染色體都含有一定數(shù)量、一定排列順序、一定寬窄和染色深淺或明暗不同的帶,這就構(gòu)成了每條染色體的帶型。顯示染色體帶的過程稱為染色體顯帶。v染色體顯帶為染色體的研究提供了一個十分有效的方法。v染色體的顯帶技術(shù)分為兩大類:一類為整條染色體的顯帶技術(shù)；另一類為染色體局部的顯帶技術(shù)。奧芬蘭海水硝化細菌熒光原位雜交奧芬蘭海水硝化細菌熒光原位雜交全菌（采用EUB MIX型探針）氨氧化細菌（采用NSO1225型探針）全菌（采用EUB MIX型探針）亞硝酸鹽氧化細菌（采用NIT3型探針） 熒光原位雜交熒光原位雜交特點特點v 優(yōu)點v1

12、、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；v2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；v3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；v4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；v5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；v6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。v 缺點v1、不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。v2、必須在已知探針的情況下方可進行。FISH技術(shù)新進展技術(shù)新進展v隨著FISH的廣泛應用，F(xiàn)ISH本身也得到長足進步。這主要表現(xiàn)在以下幾個方面：v探針 由最初的每次雜交用一種探針發(fā)展為每次雜交用多種探針，即由單色熒光原位雜交發(fā)展為多色熒光原位雜交v標記物質(zhì) 由單一的幾種發(fā)展為現(xiàn)在的幾十種v雜交步驟和過程 分別由20多步、15h縮減為不到10步、2hv v一、基因定位v二、物理圖譜的構(gòu)建v三、染色體結(jié)構(gòu)分析與數(shù)目測定v四、物種起源、進化和親緣關(guān)系研究v五、轉(zhuǎn)基因的細胞學鑒定v六、基因表達分析和臨床病毒學檢測熒光原位雜交熒光原位雜交的