1、酶的催化活性和調理機制酶的催化活性和調理機制(1)主要內容引見主要內容引見酶是生物催化劑酶是生物催化劑酶的構造與催化功能酶的構造與催化功能酶促反響機制酶促反響機制酶的調理作用酶的調理作用酶活性分析酶活性分析一、酶是生物催化劑一、酶是生物催化劑1.1 酶的研討歷史酶的研討歷史18世紀初，人們留意到胃液能對肉類進展消世紀初，人們留意到胃液能對肉類進展消化，唾液及植物提取物能將淀粉轉變為糖；化，唾液及植物提取物能將淀粉轉變為糖；1837年，年，Berzelius以為發酵活動由活細胞呵以為發酵活動由活細胞呵斥的，首先想到了催化作用；斥的，首先想到了催化作用；1857年年 Pasteur以為酒發酵是酵素

2、催化作用以為酒發酵是酵素催化作用的結果；的結果；1878年年Kuhne提出提出enzyme一詞；一詞；1894年年Fisher提出酶與底物作用的提出酶與底物作用的“鎖與鑰鎖與鑰匙學說，用以解釋酶匙學說，用以解釋酶 作用的專注性。作用的專注性。1.1 酶的研討歷史酶的研討歷史v1897年年Buchner用酵母菌提取液完成發酵，證明了發用酵母菌提取液完成發酵，證明了發酵是酶作用的化學本質；酵是酶作用的化學本質；v1903年年Henri提出酶與底物作用的中間復合物學說；提出酶與底物作用的中間復合物學說；v1913年年Michaelis和和Menten提出酶動力學原理和米氏提出酶動力學原理和米氏方程式

3、；方程式；v1925年年Briggs和和Handane對米氏方程作了修正；對米氏方程作了修正；v1926年年Sumner從刀豆中結晶了脲酶，并證明酶是蛋從刀豆中結晶了脲酶，并證明酶是蛋白質，提出白質，提出“一切的酶都是蛋白質；一切的酶都是蛋白質；v1930年年Northrop結晶了胃蛋白酶和胰蛋白酶，確定結晶了胃蛋白酶和胰蛋白酶，確定了酶的蛋白質本質；了酶的蛋白質本質；1.1 酶的研討歷史酶的研討歷史v1946年年Sumner和和Northrop因酶的結晶和對酶的研討獲得因酶的結晶和對酶的研討獲得諾貝爾化學獎；諾貝爾化學獎；v1965年年Blake對溶菌酶結晶進展了對溶菌酶結晶進展了X光衍射分

4、析，使該酶光衍射分析，使該酶活性中心的催化反響機制獲得直接證據；活性中心的催化反響機制獲得直接證據；v1969年，年，Gutte和和Merrifield用有機合成方法制得核糖核用有機合成方法制得核糖核酸酶，并證明酶與無機催化劑作用一樣；酸酶，并證明酶與無機催化劑作用一樣；v1982年年Cech發現個別發現個別RNA具有酶的催化活性，更新了具有酶的催化活性，更新了“酶是蛋白質的概念；酶是蛋白質的概念；v1983年年Altman和和Pace證明證明RNase P中中RNA具催化活性。具催化活性。1.1 酶的研討歷史酶的研討歷史v1986年年Lerner初次研制勝利了水解羧酸酯的抗初次研制勝利了水解

5、羧酸酯的抗體酶體酶Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 6736；Science, 1986, 234(4783): 1566).v1994年年Joyce發現發現DNA具有催化活性具有催化活性chem biol 1994, 1(4): 223-9)。v酶的新概念：酶的新概念：v 酶是生物體內一類具有催化活性和特殊空酶是生物體內一類具有催化活性和特殊空間構象的生物大分子，包括蛋白質和核酸。間構象的生物大分子，包括蛋白質和核酸。1.2 酶的特性酶的特性酶和普通催化劑的共性：酶和普通催化劑的共性：1.用量少而催化效率高；用量少而催化效率高；2.能加快化學反響的速度，而其

6、本身在反能加快化學反響的速度，而其本身在反響前后沒有構造和性質的改動；響前后沒有構造和性質的改動；3.催化劑只能縮短反響到達平衡所需的時催化劑只能縮短反響到達平衡所需的時間，而不能改動反響的平衡點，酶亦如間，而不能改動反響的平衡點，酶亦如此。此。4.降低反響的活化能。降低反響的活化能。1.2 酶的特性酶的特性 酶作為生物催化劑，還具有以下特點：酶作為生物催化劑，還具有以下特點：催化效率高：酶催化反響的速率比非酶催化反響催化效率高：酶催化反響的速率比非酶催化反響的速率高的速率高1081020，比普通催化劑高，比普通催化劑高1071013。催化作用有高度專注性：一種酶只能催化一種或催化作用有高度專

7、注性：一種酶只能催化一種或一類反響，作用于一種或一類物質。一類反響，作用于一種或一類物質。1.2 酶的特性酶的特性v催化作用要求一定的溫度與催化作用要求一定的溫度與pH值：如值：如NH3的合成在植物中由固氮酶來催化，通常在的合成在植物中由固氮酶來催化，通常在27C和中性和中性pH值下進展。值下進展。v酶易失活：強酸、強堿、高溫等條件都能酶易失活：強酸、強堿、高溫等條件都能使酶破壞而完全失去活性。使酶破壞而完全失去活性。v酶的活力受調理控制酶的活力受調理控制: 酶活力與輔酶、輔基、酶活力與輔酶、輔基、底物、金屬離子等親密相關。底物、金屬離子等親密相關。1.3 酶的組成酶的組成v全酶：酶蛋白與酶活

8、力所需的任何方式輔助因全酶：酶蛋白與酶活力所需的任何方式輔助因子所組成的完好功能的復合體。子所組成的完好功能的復合體。v輔酶：在酶的催化過程中一類小分子化合物，輔酶：在酶的催化過程中一類小分子化合物，擔任運載底物的電子或基團，與酶蛋白結合松擔任運載底物的電子或基團，與酶蛋白結合松弛，可作為多種酶蛋白的輔助因子，如弛，可作為多種酶蛋白的輔助因子，如NAD+、NADP+等。等。v輔基：與輔酶的作用一樣，只是與酶蛋白結合輔基：與輔酶的作用一樣，只是與酶蛋白結合嚴密，從不與酶蛋白分別，如血紅素、黃素腺嚴密，從不與酶蛋白分別，如血紅素、黃素腺嘌呤二核苷酸等。嘌呤二核苷酸等。1.3 酶的組成酶的組成常見的

9、金屬輔助因子常見的金屬輔助因子酶酶金屬輔助因子金屬輔助因子醇脫氫酶、碳酸苷酶、羧肽酶醇脫氫酶、碳酸苷酶、羧肽酶Zn2+磷酸轉移酶、精氨酸酶磷酸轉移酶、精氨酸酶Mn2+細胞色素酶、過氧化物酶、過氧細胞色素酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、鐵氧環蛋白化氫酶、鐵氧環蛋白Fe2+、Fe3+酪氨酸酶、細胞色素氧化酶酪氨酸酶、細胞色素氧化酶Cu2+、Cu+磷酸水解酶類、磷酸轉移酶類磷酸水解酶類、磷酸轉移酶類Mg2+質膜質膜ATP酶酶Na+、K+、Mg2+丙酮酸激酶丙酮酸激酶K+、Mg2+1.3 酶的組成酶的組成常見的非金屬輔助因子常見的非金屬輔助因子類型類型 輔酶和輔基輔酶和輔基轉移基團轉移基團輔酶輔酶煙酰胺腺

10、嘌呤二核苷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)H、電子（與、電子（與VPP有關）有關）輔酶輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸H、電子（與、電子（與VPP有關）有關）輔酶輔酶輔酶輔酶QH、電子、電子輔酶輔酶焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素醛類醛類輔酶輔酶輔酶輔酶A、硫鋅酰胺、硫鋅酰胺酰類酰類輔酶輔酶鈷胺酰胺輔酶類鈷胺酰胺輔酶類烷類烷類輔酶輔酶生物胞素生物胞素二氧化碳二氧化碳輔酶輔酶磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛氨基氨基輔酶輔酶四氫葉酸輔酶類四氫葉酸輔酶類甲基、亞甲基、甲酰基、亞氨甲基甲基、亞甲基、甲酰基、亞氨甲基輔基輔基黃素單核苷酸黃素單核苷酸（FMN）H（與（與VB2有關）有關）輔基輔基黃素腺

11、嘌呤二核苷酸黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）H（與（與VB2有關）有關）輔基輔基鐵卟啉鐵卟啉電子電子1.3 酶的組成酶的組成根據酶蛋白分子的特點，將酶分為：根據酶蛋白分子的特點，將酶分為：單體酶：由一條多肽鏈構成單體酶：由一條多肽鏈構成,普通為催化水解反響普通為催化水解反響的酶的酶,如胰蛋白酶、溶菌酶等如胰蛋白酶、溶菌酶等, Mr為為1335KDa。寡聚酶：有多條一樣或不同的多肽鏈組成，能夠寡聚酶：有多條一樣或不同的多肽鏈組成，能夠為別構酶，為別構酶，Mr為為35幾百萬道爾頓。幾百萬道爾頓。多酶體系：由多種酶嵌合構成的復合體，分子量多酶體系：由多種酶嵌合構成的復合體，分子量宏大，往往上一個酶產物是

12、下一個酶底物。有宏大，往往上一個酶產物是下一個酶底物。有三種方式：游離形狀、固定于膜上或組成復合三種方式：游離形狀、固定于膜上或組成復合體反響中間物普通不分開酶復合體。體反響中間物普通不分開酶復合體。二、酶的構造與催化功能二、酶的構造與催化功能 2.1 酶的一級構造與催化活性酶的一級構造與催化活性活性中心：酶分子上參與底物結合與催化作用的少數活性中心：酶分子上參與底物結合與催化作用的少數特殊的氨基酸殘基較集中的區域。特殊的氨基酸殘基較集中的區域。 普通以為活性中心有兩個功能部位：普通以為活性中心有兩個功能部位： A. 催化部位：底物的鍵在此處被打斷或構成新鍵；催化部位：底物的鍵在此處被打斷或構

13、成新鍵； B. 結合部位：底物分子靠此部位結合到酶分子上。結合部位：底物分子靠此部位結合到酶分子上。肽鍵：蛋白質酶一級構造的主鍵，斷裂后酶失活。肽鍵：蛋白質酶一級構造的主鍵，斷裂后酶失活。二硫鍵：斷裂后影響酶的空間構造及活性。二硫鍵：斷裂后影響酶的空間構造及活性。2.1 酶的一級構造與催化活性酶的一級構造與催化活性v與酶活性嚴密相關的序列：是酶活性的關鍵，在與酶活性嚴密相關的序列：是酶活性的關鍵，在進化中具高度保守性。如磷酸甘油醛脫氫酶在不進化中具高度保守性。如磷酸甘油醛脫氫酶在不同的生物中，一活性同的生物中，一活性CysCys前后的前后的1717個氨基酸一樣：個氨基酸一樣：v Val-Ser

14、-Asn-Ala-Ser-CysVal-Ser-Asn-Ala-Ser-Cys* *-Thr-Thr-Thr-Thr-Asn-Cys-Leu-Ala-Pro-Leu-Ala-Lys-ValAsn-Cys-Leu-Ala-Pro-Leu-Ala-Lys-Valv活性氨基酸：活性中心中常見的氨基酸如活性氨基酸：活性中心中常見的氨基酸如Cys, Cys, His, Ser His, Ser 等。來源于不同酶的活性氨基酸功能等。來源于不同酶的活性氨基酸功能一樣，如胰蛋白酶中的活性一樣，如胰蛋白酶中的活性SerSer和菠蘿蛋白酶中的和菠蘿蛋白酶中的活性活性CysCys功能一樣。功能一樣。2.2 酶的二、

15、三級構造與催化活性酶的二、三級構造與催化活性v酶的二級、三級構造是一切酶必備的空間酶的二級、三級構造是一切酶必備的空間構造，是維持酶活性中心的必需構型。二構造，是維持酶活性中心的必需構型。二者的改動可使構成有利于催化作用的構型者的改動可使構成有利于催化作用的構型而發揚作用而發揚作用“誘導契合學說的根底誘導契合學說的根底v酶分子的肽鏈大部分不是螺旋而是酶分子的肽鏈大部分不是螺旋而是折疊，折疊，其間以其間以螺旋及折疊肽段相連。螺旋及折疊肽段相連。 2.2 酶的二、三級構造與催化活性酶的二、三級構造與催化活性 酶的構造特點：酶的構造特點：酶分子中的肽鏈通常都緊湊包裝呈球狀或橢圓狀；酶分子中的肽鏈通常

16、都緊湊包裝呈球狀或橢圓狀；球外表有幾個凹槽。球外表有幾個凹槽。酶的活性中心位于蛋白分子外表的凹槽，凹槽內酶的活性中心位于蛋白分子外表的凹槽，凹槽內為疏水性氨基酸構成的疏水環境；為疏水性氨基酸構成的疏水環境；肽鏈所構成的二級構造和三級構造，在酶發生催肽鏈所構成的二級構造和三級構造，在酶發生催化作用時，空間位點相近的氨基酸會發生位移，化作用時，空間位點相近的氨基酸會發生位移，引起酶的構象變化。引起酶的構象變化。 2.2 酶的二、三級構造與催化活性酶的二、三級構造與催化活性v酶活性中心的酶活性中心的 空間構型在底物的作用下能發生空間構型在底物的作用下能發生改動以行使催化功能。如羧肽酶改動以行使催化功

17、能。如羧肽酶A，由，由307個氨個氨基酸組成的單一肽鏈，當和底物基酸組成的單一肽鏈，當和底物Gly-Tyr結合結合時，時，Tyr248的酚羥基挪動的酚羥基挪動1.2nm，與酰胺鍵的，與酰胺鍵的N原子構成氫鍵；原子構成氫鍵；Arg145挪動挪動2nm與底物羧基與底物羧基構成氫鍵；構成氫鍵；Glu270挪動挪動0.2nm, 經過水分子與底經過水分子與底物物氨基構成氫鍵。氨基構成氫鍵。v但假設底物換成但假設底物換成Lys-Tyr時，酶不會發生構象時，酶不會發生構象變化。變化。2.3 酶的四級構造與催化活性酶的四級構造與催化活性v酶的四級構造及亞基與催化活性酶的四級構造及亞基與催化活性v 每個亞基都具

18、有催化功能，用適當每個亞基都具有催化功能，用適當方法分別后，每個亞基都具有生物活性，方法分別后，每個亞基都具有生物活性，否那么各亞基將失去催化活性。如天冬否那么各亞基將失去催化活性。如天冬氨酸轉氨酶，用琥珀酰化方法將亞基分氨酸轉氨酶，用琥珀酰化方法將亞基分別后，每個亞基都具有生物活性；而用別后，每個亞基都具有生物活性；而用酸，堿和外表活性劑破壞四級構造時，酸，堿和外表活性劑破壞四級構造時，所得的亞基那么沒有催化活性，這是由所得的亞基那么沒有催化活性，這是由于所運用的化學藥劑抑制了酶活性所呵于所運用的化學藥劑抑制了酶活性所呵斥的。斥的。2.3 酶的四級構造與催化活性酶的四級構造與催化活性v酶的四

19、級構造與代謝調理酶的四級構造與代謝調理v 酶的亞基有調理和催化兩種：催化酶的亞基有調理和催化兩種：催化亞基具有催化功能，但受調理亞基影響，亞基具有催化功能，但受調理亞基影響，如調理亞基有激活中心和抑制中心，可如調理亞基有激活中心和抑制中心，可分別與激活劑和抑制劑結合，使酶的活分別與激活劑和抑制劑結合，使酶的活性遭到激活或抑制，從而調理酶反響的性遭到激活或抑制，從而調理酶反響的速度和代謝進程。速度和代謝進程。三、酶促反響機制三、酶促反響機制3.1 酶作用的專注性酶作用的專注性專注性種類：根據酶對底物的選擇分專注性種類：根據酶對底物的選擇分 A. 構造專注性：酶對底物的構造有一定的構造專注性：酶對

20、底物的構造有一定的要求，如酶作用點的鍵，鍵兩端基團等；要求，如酶作用點的鍵，鍵兩端基團等； B. 立體專注性：酶對底物的立體構造有立體專注性：酶對底物的立體構造有一定的要求。又分為旋光異構專注性一定的要求。又分為旋光異構專注性如胰蛋白酶只作用于如胰蛋白酶只作用于L-AA殘基構成的殘基構成的肽鍵和幾何異構專注性如琥珀酸脫肽鍵和幾何異構專注性如琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，而不能生成順丁烯二酸。而不能生成順丁烯二酸。3.1 酶作用的專注性酶作用的專注性3.1 酶作用的專注性酶作用的專注性v專注性的機理：專注性的機理：“鎖與鑰匙假說鎖與鑰匙假說(18

21、94, (1894, Fisher)Fisher)，“誘導契合假說誘導契合假說(1958, Koshland)(1958, Koshland)；v專注性研討的意義：專注性研討的意義：v A A 了解生命景象了解生命景象: :生物有序代謝及酶作用機制生物有序代謝及酶作用機制; ;v B B 指點工業消費；指點工業消費；v C C 物質構造分析；物質構造分析； v D D 用于藥物手性體的合成和拆分。用于藥物手性體的合成和拆分。3.1 酶作用的專注性酶作用的專注性3.1 酶作用的專注性酶作用的專注性v酶專注性研討的普通方法：首先挑選被酶解的酶專注性研討的普通方法：首先挑選被酶解的活性底物，對底物構

22、造進展切除或化學修飾；活性底物，對底物構造進展切除或化學修飾；最好對一種以上的底物進展類似的處置，以驗最好對一種以上的底物進展類似的處置，以驗證專注性。證專注性。v酶反響專注性研討例如：酶反響專注性研討例如：v 以紅曲酶葡萄糖淀粉酶以紅曲酶葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.4.)(EC3.2.1.4.)為為例，底物用多糖、寡糖，結果如下表：例，底物用多糖、寡糖，結果如下表：底物底物濃度（濃度（%）結構特征結構特征水解限度水解限度(%)直鏈淀粉直鏈淀粉0.1-1,4糖苷鍵，直鏈糖苷鍵，直鏈100支鏈淀粉支鏈淀粉0.25-1,4糖苷鍵和糖苷鍵和-1,6糖苷鍵糖苷鍵, 分支分支91.3茁霉多糖茁霉多糖0

23、.25-1,4糖苷鍵和糖苷鍵和-1,6糖苷鍵糖苷鍵, 分支分支8.7右旋糖苷右旋糖苷0.25-1,4糖苷鍵和糖苷鍵和-1,6糖苷鍵糖苷鍵, 分支分支0-環糊精環糊精0.25-1,4糖苷鍵，糖苷鍵，6糖成環糖成環0-環糊精環糊精0.25-1,4糖苷鍵，糖苷鍵，7糖成環糖成環0-環糊精環糊精0.25-1,4糖苷鍵，糖苷鍵，8糖成環糖成環0麥芽糖麥芽糖0.1-1,4糖苷鍵，雙糖糖苷鍵，雙糖100異麥芽糖異麥芽糖0.1-1,6糖苷鍵，雙糖糖苷鍵，雙糖1.4纖維二糖纖維二糖0.1 -1,4糖苷鍵，雙糖糖苷鍵，雙糖0紅曲霉葡萄糖淀粉酶對不同底物的水解限制紅曲霉葡萄糖淀粉酶對不同底物的水解限制結論：專注性水

24、解結論：專注性水解-1,4糖苷鍵，且為線形分子糖苷鍵，且為線形分子3.2 酶促反響的本質酶促反響的本質v酶的逼近與定位功能酶的逼近與定位功能 v 酶能使溶液中游離的分子、基團或原子酶能使溶液中游離的分子、基團或原子逼近底物分子，并使其定位不動，增大親核攻逼近底物分子，并使其定位不動，增大親核攻擊時機，從而加快反響速度。擊時機，從而加快反響速度。v 酶與專注性底物結合時，酶蛋白分子會酶與專注性底物結合時，酶蛋白分子會發生一定的構象變化，使其催化基團與結合基發生一定的構象變化，使其催化基團與結合基團的正確陳列并定位，便于底物分子逼近及定團的正確陳列并定位，便于底物分子逼近及定位。位。3.2 酶促反

25、響的本質酶促反響的本質v底物分子變形與扭曲底物分子變形與扭曲v 酶與專注性底物相互作用時，底物分子酶與專注性底物相互作用時，底物分子在酶的作用下發生變化，敏感的基團電子云密在酶的作用下發生變化，敏感的基團電子云密度增高或降低，產生度增高或降低，產生“電子張力，變得更為電子張力，變得更為敏感，易于構成過度態構型，加快反響發生。敏感，易于構成過度態構型，加快反響發生。v酸堿催化酸堿催化v 即質子受體和供體的催化。酶分子側鏈即質子受體和供體的催化。酶分子側鏈上有些功能基團如上有些功能基團如-NH3、-COOH、-SH、酚、酚羥基及咪唑基等，具有質子授受功能，執行酸羥基及咪唑基等，具有質子授受功能，執

26、行酸堿催化。堿催化。3.2 酶促反響的本質酶促反響的本質v共價催化共價催化v 酶與底物分子共價結合構成高活性的中酶與底物分子共價結合構成高活性的中間產物，此產物很容易變成過度態，大大降低間產物，此產物很容易變成過度態，大大降低反響的活化能而加快催化反響的進展。反響的活化能而加快催化反響的進展。v 親核催化是其中之一。酶分子中有很多親親核催化是其中之一。酶分子中有很多親核基團如核基團如-NH3、-COOH、-SH、酚羥基及咪、酚羥基及咪唑基等，親電基團唑基等，親電基團H+，各種金屬離子及輔酶，各種金屬離子及輔酶的親核中心等。的親核中心等。3.2 酶促反響的本質酶促反響的本質v酶分子活性中心低介電

27、性酶分子活性中心低介電性v 一些酶的活性中心為非極性的，其催化一些酶的活性中心為非極性的，其催化基團被低介電環境所包圍。這有利于專注性底基團被低介電環境所包圍。這有利于專注性底物分子敏感鍵與催化基團反響，加快反響進展。物分子敏感鍵與催化基團反響，加快反響進展。如溶菌酶底物結合部位的狹長裂痕，提供了特如溶菌酶底物結合部位的狹長裂痕，提供了特殊結合環境。殊結合環境。v 同時，由于酶的此類性質，改動了反響的同時，由于酶的此類性質，改動了反響的環境，也有利于催化反響的進展。環境，也有利于催化反響的進展。3.3 酶促反響機制的研討方法酶促反響機制的研討方法1. 動力學研討動力學研討 在實驗中改動酶促反響

28、條件，利用酶動力學實在實驗中改動酶促反響條件，利用酶動力學實際對獲得的數據進展分析研討。際對獲得的數據進展分析研討。 A. 改動底物濃度：研討反響復合物出現的次序；改動底物濃度：研討反響復合物出現的次序； B. 改動底物構造：用構造相近的底物調查酶促進改動底物構造：用構造相近的底物調查酶促進反響速度，可以了解結合部位和催化活性有關反響速度，可以了解結合部位和催化活性有關的結合要素，即活性部位的圖解。的結合要素，即活性部位的圖解。3.3 酶促反響機制的研討方法酶促反響機制的研討方法1. 動力學研討動力學研討 C. 可逆抑制：選擇一定的抑制劑，比較它們與底可逆抑制：選擇一定的抑制劑，比較它們與底物

29、的異同，可以測知與酶活性部位相關的構造，物的異同，可以測知與酶活性部位相關的構造，如如Ala-Phe-Arg是木瓜酶強有力的抑制劑。是木瓜酶強有力的抑制劑。 D. 改動改動pH條件：測定酶反響速度對條件：測定酶反響速度對pH變卦的曲變卦的曲線，能找到那些與曾經電離的線，能找到那些與曾經電離的AA側鏈的側鏈的pKa值，值，再與此再與此AA的的pKa比較，推測哪些比較，推測哪些AA與酶活性有與酶活性有關。關。 E. 恒態前反響動力學：檢測恒態前反響動力學：檢測ES構成及分解速度。構成及分解速度。3.3 酶促反響機制的研討方法酶促反響機制的研討方法2. 反響中間物檢測：普通難以到達，但有些酶反反響中間物檢測：普通難以到達，但有些酶反響中間物比較穩定，如胰凝乳蛋白酶催化酯類響中間物比較穩定，如胰凝乳蛋白酶催化酯類水解有一個酰基酶中間體水解有一個酰基酶中間體(Ser-195被乙酰化被乙酰化)；3. X射線晶體衍射：比較煩瑣，但可以得到酶底射線晶體衍射：比較煩瑣，但可以得到酶底物復合物精細構造；物復合物精細構造；4. 氨基酸