1、土壤細菌的分離及純化實驗(shyn)二土壤(trng)微生物的分離純化與鑒定第一頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 一 、目的(md)要求1.通過從土壤中分離純化細菌，掌握培養基的制備(zhbi)與滅菌技術、微生物的分離純化方法和無菌操作技術。2.掌握微生物的鑒定技術第二頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化第一(dy)部分培養基的配制(pizh)與滅菌第三頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化一、實驗(shyn)目的l1.學習配制培養基的原理，并掌握(zhngw)配制培養基的一般方法和步驟。l2.學習幾種常用培養基的配制、分裝和滅菌的操作方法.l3.進一步熟練掌握高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。第四

2、頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化二、實驗(shyn)原理（1）l培養基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質(j zh)，用以培養、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中，微生物種類繁多，營養類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養基的種類很多。但是，不同種類的培養基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對 pH 要求不一樣，霉菌和酵母的培養基的 pH 一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養基的 pH 一般為中性或微堿性的 ( 嗜堿細菌和嗜酸細菌例外 ) 。所以配制培養基時，都要根據不同微生物的要求將培養基的 pH 調到合適的范

3、圍。 l此外，由于配制培養的各類營養物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養分和改變培養的酸堿度所帶來不利的影響。 第五頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化二、實驗(shyn)原理（2）l根據微生物的種類和實驗目的不同，培養基的類別如下： l 按成分的不同按成分的不同：天然培養基 、合成培養基和半合成培養基 。l按培養基的物理狀態分按培養基的物理狀態分：固體培養基、半固體培養基和液體培養基。l按培養基的用途分按培養基的用途分：基礎培養基 、營養(yngyng)培養基（加富培養基）、鑒別培養基和選擇培養基 。

4、 第六頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化二、實驗(shyn)原理（3）l目前已有各種商品化的“干燥培養基”成品出售。這種培養基是將新鮮配制的液體培養基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發干燥法等將培養基內所含的水分去掉(q dio)；或將培養基內的各種固形成分，經適當處理、充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，經溶解、分裝，高壓蒸氣滅菌，即可使用。這種培養基的優點是配制省時，攜帶方便，使用簡易，質量穩定。 第七頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 三、實驗(shyn)器材l1.藥品及試劑藥品及試劑：根據所要制備的培養基準備所需試劑。l2.儀器及其它儀器及其它：試管

5、、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(shzh)(5.5-9.0) 、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH試紙(shzh)等第八頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 四、實驗(shyn)步驟培養基的制備與分裝1.稱量稱量：按培養基配方比例依次準確地稱取藥品。2.熔化熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。3.調調pH ：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調pH至培養基所需pH。4.過濾：過濾：趁熱用多層紗布過濾（根據實際情況確定是否過濾）5.分裝分裝：將溶化的固體培養基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培

6、養基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞加棉塞：培養基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后(rnhu)包扎一層牛皮紙。試管應先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標簽，注明培養基名稱、日期、組別。第九頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、實驗步驟(bzhu)無菌水的制備1.用量筒量取90ml水于帶玻璃(b l)珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。2.用10ml吸管取9ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮

7、紙。第十頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、實驗步驟(bzhu)器皿的準備1.培養皿的包裝培養皿的包裝(bozhung)：每10套一包，用舊報紙或牛皮紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴）。2.吸管的包裝吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結。3.玻璃涂布棒的包裝：玻璃涂布棒的包裝：方法同吸管的包裝。4.槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。第十一頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、實驗(shyn)步驟高壓滅菌1.將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內，根據需要設定滅菌溫度和時間(shjin)（一般121，20min滅菌，若培養基中含有葡萄糖等成分時，113 ，30

8、min滅菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。2.滅菌完畢，將試管培養基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養基冷至50左右，倒平板。3.將滅菌的培養基放入37的溫室中培養2448h，以檢查滅菌是否徹底。第十二頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化五、思考題l1.培養基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養菌是無菌的？l2.加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否(sh fu)只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達到所需滅菌溫度？為什么？第十三頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化第二(d r)部分微生物的分離(fnl)與純化第十四頁，共三十六頁。土壤細菌的分離

9、及純化一、目的(md)要求1.通過從土壤中分離純化細菌，掌握微生物的分離純化方法和無菌操作技術。2.初步(chb)掌握微生物的菌種保藏技術。第十五頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 二、實驗(shyn)原理（1）l自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養狀態。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。l土壤是微生物生活的大本營，可以從中分離到很多有價值的菌株。本實驗(shyn)將采用平板劃線分離法。第十六頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化三、實驗(shyn)器材l土樣l培養基l無菌的培養皿、三角瓶、水、玻璃(b l)

10、珠、玻璃(b l)刮刀、吸管、槍尖等第十七頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（1）l制備(zhbi)土壤稀釋液l涂布平板l培養l挑菌落l平板劃線分離l菌種保藏（留作鑒定）第十八頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四 操作步驟（2）1制備(zhbi)土壤稀釋液 第十九頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（3）l挑菌落(jnlu)接種(jizhng)和分離工具1接種針 2.接種環 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 第二十頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（4）第二十一頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（4）第二

11、十二頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化劃線接種點接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種四、操作步驟（5）第二十三頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌(mi jn) (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌(mi jn) (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞 四、操作步驟（6）第二十四頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（7）平板(pngbn)劃線法第二十五頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 平板劃線分離的方法平板劃線分離的方法1.斜線法 2.曲線法 3.方格(fn )法 4.放射法 5.四格法四、操作步驟（8）平板(pngbn)劃線法第二十六頁，共三

12、十六頁。土壤細菌的分離及純化l制備土壤(trng)稀釋液時，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。 l注意無菌操作。五 注意事項第二十七頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化 六 思考題l試擬出從土壤中分離芽孢桿菌的主要實驗步驟。l如何檢驗平板(pngbn)上某個單菌落是不是純培養？第二十八頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化第三(d sn)部分 分離(fnl)菌株的鑒定第二十九頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化一、目的(md)要求l掌握常用的微生物鑒定方法。l掌握生理生化試驗(shyn)的原理與方法。l復習以前學過的各種染色方法第三十頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化二、實驗(shyn)原理1、

13、微生物的分類鑒定是微生物的重要內容，一般從菌落特征、細菌特點及生理生化、分子生物學等方面進行鑒定。2、各種細菌在代謝類型上表現了很大的差異。不同的細菌分解大分子碳水化合物、蛋白質和脂肪的能力不同，所能發酵的類型和最終產物也不一樣。不同細菌對營養的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統。細菌的這種生化反應的多樣性在自然界產生了兩種結果：第一、使自然界所有的有機分子都有可能得到分解；第二、使不同細菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產物。另一方面，微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一,細菌的生化反應的多樣性也被

14、人們作為細菌的鑒定和分類方法來利用，可以鑒別一些在形態和其它方面不易(b y)區別的微生物。 第三十一頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化三、實驗(shyn)器材l1試劑：試劑：各種染色液、生理(shngl)生化用試劑等l2微生物材料：微生物材料：學生自己分離純化的菌種l3 其他器材：其他器材：生理生化培養基、接種環、培養箱等第三十二頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（1）l記錄(jl)菌種的培養特征l革蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性l芽孢染色l鞭毛染色l查伯杰氏手冊，初步對菌種進行鑒定。第三十三頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化四、操作步驟（2）l做以下基礎實驗：l一、糖酵解試驗l二、淀粉水解試驗l三：V-P試驗l四：甲基紅（Methyl Red）試驗l然后根據學生自己前期對菌種的初步判定結果(ji gu)，有針對性地加2-3個生理生化實驗進一步鑒定。第三十四頁，共三十六頁。土壤細菌的分離及純化五、實驗報告l根據論文(lnwn)發