1、第五章重組DNA技術 (2)現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，得益于上個世紀中現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，得益于上個世紀中葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步。術的進步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、雜交、電分子的切割與連接、雜交、電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、表泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達、定點突變和達、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核擴增等，是分子生物學研究的核心技術。心技術。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它

2、載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其它技術的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術

3、區(qū)別于其它技術的根本特征。根本特征。重組重組DNADNA技術發(fā)展史上的重大事件技術發(fā)展史上的重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世紀世紀4040年代確定了遺傳信息的攜帶者、即年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是基因的分子載體是DNADNA而不是蛋白質，解決了遺傳而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；的物質基礎問題；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的雙螺旋結構模型和分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制半保留復制機制, ,解決了基因的自我復制和世代解決了基因的自我復制和世代交替問題；交替問題；三、三、5050年代末至年代末至6060年代，相繼提出了年代，

4、相繼提出了“中心法則中心法則”和操和操縱子學說縱子學說, ,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。流動與表達機制。5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）（一）限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶能夠識別能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點上的特定堿基序列并從這個位點切開切開DNA分子。分子。第一個核酸內切酶第一個核酸內切酶EcoRI是是Boyer實驗室在實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙序列，將雙鏈鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端分子在這個位點切開并產生具有粘性末

5、端的小片段。的小片段。 圖圖5-1 幾種主要幾種主要DNA內切酶所識別的序列及其酶切內切酶所識別的序列及其酶切末端末端。（二）基因克隆的載體（二）基因克隆的載體 我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和和DNA連接酶進行連接酶進行DNA的切割和重組，還遠遠的切割和重組，還遠遠不能滿足基因工程的要求，因為大多數(shù)不能滿足基因工程的要求，因為大多數(shù) DNA片片段不具備自我復制的能力，只有將他們連接到段不具備自我復制的能力，只有將他們連接到具備自主復制能力的具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖。細胞中進行繁殖。載體（載體（

6、vector)是指具備自主復制的是指具備自主復制的DNA分子，象病分子，象病毒、噬菌體和質粒等相對分子量較小的復制子均可毒、噬菌體和質粒等相對分子量較小的復制子均可以作為基因導入的載體。以作為基因導入的載體。載體三要素：載體三要素：自我復制能力；自我復制能力；攜帶外源基因片段大小（具有較小的分子量和較高攜帶外源基因片段大小（具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)）；的拷貝數(shù)）；插入位點多少（具有若干限制酶單一識別位點）；插入位點多少（具有若干限制酶單一識別位點）；易于鑒定識別（具有抗菌素抗性基因）易于鑒定識別（具有抗菌素抗性基因）大腸桿菌質粒載體大腸桿菌質粒載體: 1、pSC101質粒載體質粒載體低拷

7、貝數(shù)嚴緊型復制控制的大腸桿菌質粒載體，低拷貝數(shù)嚴緊型復制控制的大腸桿菌質粒載體，平均每個寄主細胞僅有平均每個寄主細胞僅有12個拷貝。個拷貝。長長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及以及SmaI等等7種限制性核酸內切酶的單酶切位點，種限制性核酸內切酶的單酶切位點，在在HindIII、BamHI和和SalI等等3個位點插入外源基個位點插入外源基因，會導致因，會導致tetr失活。失活。 大腸桿菌大腸桿菌pSC101質質粒載體示意粒載體示意圖。圖。是第一個真核基因克隆載體。缺點：它是一種嚴是第

8、一個真核基因克隆載體。缺點：它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質粒，從帶有該質粒的寄緊型復制控制的低拷貝質粒，從帶有該質粒的寄主細胞中提取主細胞中提取pSC101 DNA，產量很低。，產量很低。2、ColE1質粒載體質粒載體松弛型復制控制的多拷貝質粒。松弛型復制控制的多拷貝質粒。一般情況下，當培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細一般情況下，當培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質的合成，寄主胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質的合成，寄主染色體染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。止。而松弛型質粒而松弛型質粒DNA卻繼續(xù)復制數(shù)小時，使每個

9、卻繼續(xù)復制數(shù)小時，使每個寄主細胞中寄主細胞中ColE1質粒的拷貝數(shù)達到質粒的拷貝數(shù)達到10003000個，占細胞總個，占細胞總DNA的的50%左右。左右。3、pBR322質粒載體質粒載體由三個不同來源的部分組成的：由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于第一部分來源于pSF2124質粒易位子質粒易位子Tn3的氨芐青霉的氨芐青霉素抗性基因（素抗性基因（AmpR）；）；第二部分來源于第二部分來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；）；第三部分則來源于第三部分則來源于ColE1的派生質粒的派生質粒pMB1的的DNA復制起點（復制起點（ori）。）。AmpR優(yōu)點是具有

10、較小的分子量，其長度為優(yōu)點是具有較小的分子量，其長度為4 363bp。不僅易。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源的外源DNA片段，片段，操作起來仍較為便利。操作起來仍較為便利。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉化子的選擇記號。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉化子的選擇記號。有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積累積1000300010003000個拷貝，為重組體個拷貝，為重組體DNADNA的制備提供了極的制備提供了極大的方便。大的方便。4、pUC質粒載體（包括四個部分）：質粒載體（包括四個部分）：(i)

11、來自來自pBR322質粒的復制起點（質粒的復制起點（ori）；）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因（ampr）；）；(iii)大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖酶基因（半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及）的啟動子及其編碼其編碼-肽鏈的肽鏈的DNA序列，此結構特稱為序列，此結構特稱為lacZ基基因；因；(iv)位于位于lacZ 基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多克隆位點端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ 基因基因的功能。的功能。優(yōu)點：優(yōu)點： 更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎上構基礎上構建建

12、pUC質粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性質粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，其分子小了許多，基因及復制起點，其分子小了許多，pUC8為為2750bp，pUC18為為2686bp。由于缺失。由于缺失rop基因，基因，pUC質粒不經(jīng)氯質粒不經(jīng)氯霉素擴增時，平均每個細胞即可達霉素擴增時，平均每個細胞即可達500700個拷貝個拷貝。可用組織化學方法檢測重組體。可用組織化學方法檢測重組體。pUC8質粒結構中具有質粒結構中具有來自大腸桿菌來自大腸桿菌lac操縱子的操縱子的lacZ基因，所編碼的基因，所編碼的-肽鏈肽鏈可參與可參與-互補作用。因此，可用互補作用。因此，可用X-gal

13、顯色法實現(xiàn)對重顯色法實現(xiàn)對重組體轉化子的鑒定。組體轉化子的鑒定。具有多克隆位點具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如末端（如EcoRI和和BamHI）的外源）的外源DNA片段直接克片段直接克隆到隆到pUC8質粒載體上。質粒載體上。5、 pGEM-3Z質粒質粒 長度為長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個基因和一個lacZ基因。基因。 含有兩個噬菌體啟動子（含有兩個噬菌體啟動子（T7和和SP6），為），為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。加入點。加入T7或或SP6

14、RNA聚合酶，所克隆的外源聚合酶，所克隆的外源基因便會轉錄出相應的基因便會轉錄出相應的mRNA。6、穿梭質粒載體（、穿梭質粒載體（shuttle plasmid vector） 指由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記指由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。由于這類質粒載體可以保證外源體。由于這類質粒載體可以保證外源DNA序列在不同序列在不同物種的細胞之間得到擴增，能在原核和真核細胞之間物種的細胞之間得到擴增，能在原核和真核細胞之間往返穿梭，具有廣泛的用途。往返穿梭，具有廣泛的用途。7、pBlu

15、escript噬菌粒載體噬菌粒載體 pBluescript是指由是指由Stratagene公司發(fā)展的一類從公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），），如今則更多地叫作如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或）或pBluescript SK（+/-）。）。SK表示多克隆位點區(qū)的取向，即表示多克隆位點區(qū)的取向，即lacZ基因是按照基因是按照SacIKpnI的方向轉錄；的方向轉錄；（+/ -）表示單鏈噬菌體）表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取復制起點的兩種相反的取向。向。f1（+）起點表示當）起點表示當pBlues

16、cript噬菌粒載體和輔助噬噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有基因的有意義鏈意義鏈DNA；而；而f1（-）起點則表示當）起點則表示當pBluesript噬噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到到lacZ基因的無意義鏈基因的無意義鏈DNA。(i)在多克隆位點區(qū)（在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側，存在一對）的兩側，存在一對T3和和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉錄活動；上的外源基因的轉錄活動；(ii)具有單鏈

17、噬菌體具有單鏈噬菌體M13或或f1的復制起點和一個來的復制起點和一個來自自ColE1質粒的復制起點，保證質粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii）編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉化子克）編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉化子克隆的選擇標記；隆的選擇標記；(iv)含有一個含有一個lacZ基因，可以按照基因，可以按照X-gal-IPTG組織組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。化學顯色法篩選噬菌粒載體的重

18、組子。LacZ編碼編碼-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的個氨基酸的-肽，肽， IPTG（異丙基（異丙基- -D-硫代半乳糖苷）誘導該基因表硫代半乳糖苷）誘導該基因表達，合成的達，合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽能與宿主細胞所編碼肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型的缺陷型-半乳糖苷酶相互補，產生有活性的半乳糖苷酶相互補，產生有活性的-半半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚，使生長于含哚，使生長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉化菌落呈藍色。培養(yǎng)基中的轉化菌落呈藍色。重組重組DNADNA操作過程示意圖操作過程示意圖圖圖5-2 DNA連接酶能把不同的連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體片段連接成一個整體 僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接連接酶進行酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上