1、會計學1分子能級與熒光S0S1T1hn0hn1hn22. 熒光（熒光（Fluorescence)：當處于基態的分子吸收光能后進入激發態，并且立即返回基態并以光的形式釋放能量，這種光稱為熒光。 4. 激發(Excitation, Ex)和發射(Emission, Em)光譜（Spectra):1. 能級（能級（ Energy Level）：）：原子的可能狀態是不連續的，因此各狀態對應能量也是不連續的。包含電子能級、振動能級和轉動。3. 磷光（磷光（Phosphorescence）:分子從激發三線態返回基態以光的形式釋放能量。第1頁/共14頁CFPEx. 440nmEx. 470nmEm. 470

2、nmYFPEm. 535nm熒光共振能量轉移(FRET)現象3. FRET現象的特征現象的特征: 選擇性激發供體,卻能檢測到受體發射的熒光1. 供體供體(Donor, D)Donor2. 受體受體(Acceptor, A)Acceptor第2頁/共14頁第3頁/共14頁FRET的條件66060RRRE發生發生FRETFRET需要三個條件：需要三個條件：1 1、供體分子的發射光譜和受體分子的吸收、供體分子的發射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于光譜必須有顯著的重迭，一般大于 3030；2 2、供體分子和受體分子間的距離必須在、供體分子和受體分子間的距離必須在 1 10 nm 1

3、10 nm 之間之間. D. D和和A A間的間的FRET FRET 效效率：率： 3 3、供體分子的發射態偶極矩與受體分、供體分子的發射態偶極矩與受體分子的吸收態偶極矩、以及它們的向量子的吸收態偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件必須滿足一定的條件R0: E=50%時供體和受體分子間的距離.對于特定的供體受體對是常數;R: 供體和受體分子間的距離.E: FRET效率. 對于R特別靈敏.舉例: 假設 R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5%2） R=5nm, E=50%3） R=6nm, E=25% 450 500 550 600l (nm)D EmA Ex第4頁/共14頁1)蛋

4、白分子的共定位;2)蛋白分子聚合體;3)轉錄機制;4)轉換途徑;5)分子運動;6)蛋白折疊等生物學問題.FRET的應用的應用通過 FRET 技術可以獲得有關兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息。常用于解決如下問題:第5頁/共14頁LaserLaserDAFRET技術應用一:檢測兩個發光分子間的重合與共定位第6頁/共14頁第7頁/共14頁FRET技術應用二: 檢測分子間的相互作用Laser第8頁/共14頁LaserFRET技術應用三: 檢測分子的折疊與構象變化第9頁/共14頁FRET技術應用舉例：細胞內鈣離子濃度的實時測量Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:8

5、82-887(b)第10頁/共14頁 BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED在FRET實驗中經常使用的供體-受體熒光分子對2. 綠色熒光蛋白類(Green Fluorescent Proteins, GFPs)1.染料類(Dye)FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5第11頁/共14頁參考閱讀文獻參考閱讀文獻Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation

6、 by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899909Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629633Jin Zhang, et al.,. Geneti

7、cally encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 1499715002Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599611 Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:13951398 第12頁/共14頁思思 考考 題題2.你認為FRET技術特別適合什