1、神經(jīng)組織的固定l（一）固定(fixation)l為了更好的保持細胞和組織原有的形態(tài)結構，防止組織自溶，必須對細胞和組織進行固定。固定的作用不僅是使細胞內蛋白質凝固，終止或抑制外源性和內源性酶活性。更重要的是最大限度的保存細胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉變?yōu)榉撬苄钥乖乐箍乖瓘浬?。l（二）固定劑(fixative)l醛類固定劑l雙功能交聯(lián)劑，使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點是對組織穿透性強，收縮性小。常用的醛類固定劑有10%鈣-福爾馬林液，10%中性緩沖福爾馬林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸緩沖液，戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，Bouin

2、s液等l其它固定劑：l酒精（alcohol） ：l使蛋白質脫水而致不可逆性的凝固變性。對組織有固定、硬化兼脫水的作用l醋酸（acetic acid）：l對核蛋白有明顯的沉淀作用，不能單獨使用，常與酒精聯(lián)合使用l苦味酸（picric acid）：l沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使組織柔軟。l鉻酸（chromic acid） ：l強氧化劑，能沉淀所有蛋白。重鉻酸鉀是氧化劑，對蛋白和脂類有固定作用，尤其是脂類。對核蛋白有溶解作用。l氯化汞（mercury chloride） ：l沉淀各種蛋白。但必須脫汞l鋨酸（osmium tetroxide） ：l強氧化劑。蛋白的固定作用較好，不發(fā)生沉淀，組織幾乎不收縮。

3、但滲透力弱。l丙酮（acetone）l（三）固定方法l1.浸入法l將組織浸泡在固定液內。l2.灌注法l此法適用于動物實驗研究。常用的切片方法常用的切片方法l常用的有石蠟切片法、冰凍切片法、恒冷箱切片法、振動切片法.l 石蠟切片石蠟切片(paraffin sectioning) l本法是將已固定的組織塊常規(guī)脫水處理后，放入熔化的石蠟中浸蠟，將組織包埋在石蠟中制成蠟塊，再用石蠟切片機切片(一般片厚5-10m)，然后將切片貼于載玻片上。本法適用于一般染色方法。l 冰凍切片冰凍切片(freezing sectioning) l本法是將已固定或未經(jīng)固定的組織塊經(jīng)保護處理后，用液態(tài)二氧化碳或半導體致冷裝置

4、迅速致冷凍結變硬，然后在冰凍切片機上切片。本法可不必經(jīng)脫水包埋處理，甚至可不經(jīng)固定處理，故對組織細胞內的脂類成分及酶的活性影響較少，而且方法簡單，制片速度快，缺點是難以切出10m以下的薄切片。l 恒冷箱切片法恒冷箱切片法(cryostat sectioning)l本法是在冰凍切片技術基礎上發(fā)展起來的切片技術，其特點是將己固定或未經(jīng)固定的組織塊冷凍處理后，在低溫恒冷箱中進行切片，由于切片機裝在恒冷箱內，整個切片過程在低溫環(huán)境下進行，故能更好地保存組織內各種活性物質，并可切出較薄切片，此法特別適用于細胞化學及免疫細胞化學研究。l 振動切片法振動切片法(vibration sectioning) l

5、本法是用特殊的振動切片機進行切片，振動切片機的特點是其刀片進行橫向切割運動， 故可切割新鮮未經(jīng)冰凍，末經(jīng)固定的組織，切片厚度可達10m。常用于免疫細胞化學、免疫電鏡及電生理學腦厚片技術。l5冷凍干燥切片(freezing drying sectioning)：將新鮮組織放入經(jīng)液氮預冷（-160）的異戊烷中驟冷后，入真空內干燥，已干燥的組織塊進行真空包埋后切片。其特點是細胞在驟冷的同時立即停止一切生物化學變化，可研究驟冷時細胞內的物質變化狀況。l6超薄切片(ultrathin sectioning)：通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟。固定分預固定和后固定。包埋劑多為環(huán)氧樹脂。切片用醋酸鈾及

6、枸櫞酸鉛進行電子染色，在電子顯微鏡下觀察。神經(jīng)組織的一般染色方法神經(jīng)組織的一般染色方法l 尼氏法（尼氏法（Nissl staining）l尼氏體（Nissl body）也被稱作“嗜色小體”或“虎斑小體”，其主要成份是核糖核酸（RNA）和蛋白質組成。在各種類型神經(jīng)元中，尼氏體的形狀、大小與分布均不相同。由于含有RNA，故易為某些堿性苯胺染料所染色（如甲苯胺藍，焦油紫類，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及培花青等）。本法除可顯示正常神經(jīng)元形態(tài)，特別是其內含的尼氏體情況外，還可顯示當神經(jīng)元受到損害，引致的尼氏體消失，即染色質溶解（chromatolysis），可供病理或臨床診斷和實驗研究參考。lNiss

7、l染色程序：染色程序：l切片入0.1%尼氏液中染色5至10分鐘l蒸餾水洗去染液l70%酒精分色 1分鐘l80%酒精 1-2分鐘l90%酒精 1-2分鐘l100%酒精 2分鐘l100%酒精 2分鐘l二甲苯 2分鐘l二甲苯 2分鐘l中性樹膠封片l 蘇木精伊紅染色法蘇木精伊紅染色法( hematoxyiln eosin，HE ) l本法是組織學最常用的染色方法，它可顯示組織內各種細胞結構，HE染色在神經(jīng)生物學研究中亦常采用，蘇木精是陽離子染料，可將細胞核內的嗜堿性物染成藍紫色，伊紅是陰離子染料，可將細胞質和膠原纖維等染成粉紅色。l步驟:l二甲苯脫蠟去石蠟5分鐘;l二甲苯脫蠟去石蠟5分鐘;l二甲苯脫蠟

8、去石蠟5分鐘l100%的酒精去二甲苯5分鐘;l100%的酒精去二甲苯5分鐘l90%的酒精水化2分鐘;l80%的酒精水化1分鐘;l70%的酒精水化1分鐘l用蒸餾水洗; (以上步驟統(tǒng)稱為脫蠟至水)l05%的蘇木精染色，室溫510分鐘；l水洗；l1%的鹽酸酒精分色3060秒；l水洗；l流水促藍；l1%的伊紅室溫染色2-5分鐘；l水洗；l70%的酒精分色3060秒；l80%的酒精脫水1分鐘；l90%的酒精脫水1分鐘；l100%的酒精脫水2鐘；l100%的酒精脫水2鐘；l二甲苯透明5分鐘；l二甲苯透明5分鐘；l中性樹膠封片。l結果：l1 細胞質染成紅色l2 細胞核染成藍色l Weigert 氏髓鞘染色法

9、氏髓鞘染色法l有髓神經(jīng)纖維的髓鞘主要組成成分是磷脂，如以鉻鹽或鐵釩媒染使之與蘇木精結合，再藉分色處理，就能著色清晰，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示其分布狀態(tài)。髓鞘染色除可用于顯示神經(jīng)纖維干、束外，更多用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維束的追蹤。因為，尚未髓鞘完全的纖維束（如嬰兒皮質脊髓側束），或髓化受到損害而產(chǎn)生潰變的纖維束，在與正常已髓化的纖維對比之下可以區(qū)別。用勞克堅牢藍（Luxol fast blue）類染料染色也可顯示髓鞘，操作時也較容易。但染色作用較慢，染色也較淺。l 鍍銀法（鍍銀法（silver impregnation ）l鍍銀法又名浸銀法，是用硝酸銀鍍染神經(jīng)元，一個多世紀以來，鍍銀法為神經(jīng)形態(tài)學的發(fā)展

10、作出了重大貢獻，此法于上一世紀七十年代由意大利解剖學家Golgi創(chuàng)建，故稱為Golgi氏法。到目前Golgi原法己有許多改良法，經(jīng)Cox改良的Golgi-Cox法，可以較好地顯示神經(jīng)元胞體、突起各部形態(tài)，是多年來較受歡迎的方法之一。神經(jīng)細胞化學性質顯示方法神經(jīng)細胞化學性質顯示方法l1組織化學方法組織化學方法l（1）顯示脫氧核糖核酸的孚爾根反應法）顯示脫氧核糖核酸的孚爾根反應法(Feugen reaction) 利用schiff試劑顯示細胞內DNA的經(jīng)典方法，其基本原理是組織經(jīng)鹽酸水解后打開DNA分子中脫氧核糖和嘌呤堿之間的連接鍵，使其釋放出脫氧核糖核酸中的醛基，醛基與schiff試劑中的亞硫酸

11、品紅結合，而在核內呈紅色反應沉淀物。 l（2）顯示多糖的過碘酸）顯示多糖的過碘酸-schiff反應法反應法(Periodic acid Schiff reaction)簡稱PAS法，是顯示組織或細胞內多糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通過碘酸的氧化作用，打開糖分子內1，2-乙二醇中的碳-碳鍵或糖中的的氨基，烴氨基衍生物，形成2-醛基，這些醛基與schiff試劑中的亞硫酸品紅反應，形成紫紅色化合物。l（3）顯示脂類的脂溶性染料法）顯示脂類的脂溶性染料法 顯示脂類通常用易溶于脂類的染料，使之溶于組織或細胞內的脂滴內而顯色. 常用的這類染料有: 蘇丹III (Sudan III)，蘇丹IV (Su

12、dan IV)，蘇丹黑B (Sudan black B)，油紅O (oil red O)等。l（4）顯示酶的酶細胞化學方法）顯示酶的酶細胞化學方法 酶顯示法是顯示酶的活性而不是酶的本身，細胞內含有多種酶，每一種酶都可催化一定的化學反應。酶顯示法的基本原理是具有酶活性的組織切片或涂片，在含有酶作用底物和捕獲反應產(chǎn)物的捕捉劑的孵育液中，經(jīng)一定pH及一定溫度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初級反應產(chǎn)物被捕捉劑捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最終產(chǎn)物。2免疫細胞化學方法免疫細胞化學方法l免疫細胞化學方法免疫細胞化學方法(Immunocytochemistry)是應用免疫學原理，通過抗原與特異性標記抗體結

13、合，從而顯示細胞內的抗原或抗體成分。這種方法可以定位或示蹤細胞內各種成分，包括各種蛋白質、多肽、部分類脂質和多糖以及細胞膜表面的膜抗原和受體等等。由于在組織細胞內進行的抗原抗體結合是不可見的，故需要在抗體上結合一定的可見的標記物質。l免疫組織化學染色免疫組織化學染色 l SP法l 1）脫蠟、水化；（石蠟切片，冰凍切片免此步驟）l 2）PBS洗23次各5分鐘；l 3）3%H2O2（甲醇）滴加在切片上，室溫靜置20分鐘；l 4）PBS洗23次各5分鐘； l 5）抗原修復；（石蠟切片，冰凍切片免免此步驟）l 6）PBS洗23次各5分鐘；l 7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。l

14、8）滴加抗50l，室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。l 9）4過夜后需在37復溫45分鐘。l 10）PBS洗3次各5分鐘；l 11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時；l 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。l 13）PBS洗3次各5分鐘；l 14）抗30分鐘；l 15）PBS洗3次各5分鐘；l 16）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；l 17）PBS或自來水沖洗10分鐘；l 18）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；l 19）自來水沖洗1015分鐘；l 20）脫水、透明、封片、鏡檢。 3熒光免疫細胞化學熒光免疫細胞化學l熒光免疫細胞化學熒光免疫細胞化學( i

15、mmunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用熒光染料作為標記物，標記上己知的抗原或抗體，再用標記上熒光素的抗體或抗原作探針，檢測細胞或組織內的相應抗原或抗體。當熒光素結合的抗體與被檢抗原或抗體結合，便可用熒光顯微鏡檢測到這此抗原或抗體的定位。4免疫細胞化學的雙重標記（免疫細胞化學的雙重標記（Double staining）l這一技術目的是在同一神經(jīng)細胞胞體或它的突起內同時顯示共存的兩種或兩種以上物質以研究這些物質在同一神經(jīng)元或它的突起內的共存現(xiàn)像，或含有不同化學物質的兩種結構的相互關系。 5熒光細胞化學雙標記法熒光細胞化學雙標記法l熒光細胞化學雙標記法的原理亦如

16、免疫細胞化學雙標記方法，只是第二抗體標記物是不同的熒光素，如呈黃綠色熒光的FITC及呈紅色熒光的TRITC，可將兩種不同的特異性一抗混合與切片進行孵育，但兩種一抗必須來自不同種動物。然后再與標記不同熒光素的兩種針對第一抗體的二抗混合孵育，使各自與一抗結合。最后在熒光顯微鏡下用不同的激發(fā)濾片觀察到兩種不同反應產(chǎn)物的不同的熒光。6免疫電鏡技術免疫電鏡技術l免疫電鏡技術（immunoelectron microscope technique）是免疫細胞化學與電子顯微技術結合的產(chǎn)物，用以在超微結構水平進行免疫細胞化學研究。 l此技術的關鍵問題是標記物質必須是能滿足電鏡顯微技術要求的電子致密物質，目前常

17、用的為HRP、細胞色素C，近年來隨著膠體金、納米金技術的發(fā)展，更廣泛的被采用作為免疫電鏡的標記物。 神經(jīng)膠質細胞的顯示方法神經(jīng)膠質細胞的顯示方法l過去長期以來用以顯示神經(jīng)膠質細胞的方法是基于Cajal鍍銀方法，其原理與神經(jīng)細胞鍍銀方法相同，但效果不理想。后來鍍銀方法幾經(jīng)改進，效果有所改善。l由于免疫細胞化學的應用及進展，目前已利用針對特定神經(jīng)膠質含有的特異性化學成分的抗體準確的顯示特定神經(jīng)膠質的數(shù)目及形態(tài)細節(jié)。如由于星形膠質細胞特異地含有膠質原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP），小突膠質細胞表達半乳糖腦苷脂，小膠質細胞含有植物凝集素BS-1

18、，可以應用針對各該物質的免疫細胞化學方法，顯示各類膠質細胞并得到理想的結果。立體定位技術l在動物實驗中，有時需要在較少損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的情況下，把細微的電極或導管，有目的的插入腦的某些深部結構，這種定向安置的技術為立體定位術(Stereotaxic technique of brain)。它是在腦內進行電刺激，記錄細胞放電，進行微量注射及推挽灌流等項實驗時必不可少的步驟.l某些顱外骨性標記與顱內結構具有相對固定的位置關系， 因此可利用這些骨性標記并按大白鼠，兔腦圖譜所提供的數(shù)據(jù)進行操作.根據(jù)鼠腦圖譜(KNIG F.R. and KLIPPEL A.， 1963年)所定標準，取前囟點與人字縫尖(

19、后囟)為連線，前囟高于后囟1mm為鼠腦標準頭位，但不同的鼠腦圖譜頭位標準有所不同。 l兔腦結構定位根據(jù)兔腦圖譜(Sawyer， 1954)規(guī)定(圖3-2-1-1)標準頭位是前囟高于人字縫尖1.5mm，三個座標的定位依據(jù)是：以前囟中心及人字縫尖為標記點，在人字縫尖以上1.5mm的一點(假想點)與前囟中心連一線作為假想水平線，通過此線作一與定向器立框平行的平面即為標定水平面。 由此平面向下12mm的與其平行的平面即為水平座標面(HO).HO平面向下為H-，向上為H+， 通過前囟中心與人字縫尖，并與水平座標平面垂直的平面即為矢狀座標面(LPO)。 向左則標為L， 向右則標為R，通過前囟中心與水平及矢

20、狀座標面均垂直的平面即為冠狀座標面(APO)，向前則為A，向后則為P.三個座標面均以mm記數(shù)，如A2R2H-1.5，P9L0.5H1等。神經(jīng)通路示蹤技術神經(jīng)通路示蹤技術l而神經(jīng)通路的追蹤是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的手段之一。目前常用的研究方法主要有：利用神經(jīng)元軸漿運輸現(xiàn)象的追蹤法，如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）、熒光染料（fluorscein）、放射性核素、葡萄聚糖（dextran）追蹤法、植物凝集素（lectin）及霍亂毒素（cholera toxin,CT）等等。利用神經(jīng)元胞體受損或軸突離斷后遠側軸突的變性，或軸突切斷后胞體的反應特性的變性追蹤法，包括

21、傳統(tǒng)的鍍銀法如Nauta法與目前常用的變性法與免疫組織化學方法或原位分子雜交技術結合，觀察當切斷束路(或神經(jīng))后起始神經(jīng)元胞體內化學成分的變化利用某些熒光染料如羰花青（carbocyanine）熒光染料DiI、DiA、DiO、DiS在神經(jīng)細胞質膜擴散的神經(jīng)元質膜熒光追蹤法Golgi法及活體內染料注射法l 常用的HRP追蹤法、熒光素追蹤法、放射性核素追蹤法及Nauta鍍銀法 HRP追蹤法追蹤法 lHRP是從辣根中提取出來的一組同工酶的混合物。Kristenson 等（1971）和LaVail等（1972）先后將HRP用于追蹤神經(jīng)纖維聯(lián)系，創(chuàng)造了HRP追蹤技術。HRP在注射部位被神經(jīng)末梢或神經(jīng)元胞

22、體通過非特異性整體胞飲（bulk endocytosis）的方法攝入，逆向運至胞體或順向運至末梢。HRP注射于周圍神經(jīng)感覺末梢部位逆向標記背根神經(jīng)節(jié)細胞后，還可進一步沿背根神經(jīng)節(jié)中樞突順向標記其中樞終止部位，稱跨節(jié)標記（transganglionic labeling）HRP和麥芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）共偶聯(lián)后（WGAHRP）或與霍亂毒素結合后（CTHRP）可大大提高HRP作為追蹤劑的靈敏度HRP法的基本操作步驟是麻醉動物，HRP注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍器官、神經(jīng)的一定部位，動物存活一定時間后灌注固定動物，取材制作冰凍切片，然后用過氧化氫及顯色劑來顯示HR

23、P標記。l（一） HRP的配制l中樞神經(jīng)系內注射的HRP，一般用蒸餾水或生理鹽水配成30%50%的溶液。微電泳時可用20%30%的HRP，也可用更低濃度的HRP，l（二） HRP的注射l取實驗動物麻醉后，將其固定于腦定位儀上，切開動物頭部皮膚，暴露顱骨，選擇適當?shù)淖鴺?，用開顱具在顱骨上開一小孔，將微玻管或微量注射器直接向腦內注射，HRP溶液用微量注射器注入。為了減少推進HRP溶液時液壓對組織的損傷作用，注射速度很慢。一般約為每10分鐘0.1ul。用千分尺或電動自動推進器來推進。為了減少HRP沿針道擴散，在注射后應留針1530min再徐徐拔針，將動物皮膚縫合，存活。l（三）動物的存活l 注射追蹤

24、劑后經(jīng)過多長時間處死動物，取決于被運送的速度、注射部位與標記部位間的距離、示蹤物在標記部位逐漸堆積起來所需的時間以及示蹤物在標記部位被分解的速度等因素。HRP被攝入的過程很快。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內l5min后即可被攝入神經(jīng)元中，經(jīng)24后HRP已從細胞外間隙消失，全部進入細胞內(包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質、血管周細胞及血管內皮細胞等)。HRP可在軸突內被快速運送，通常認為順向傳遞速度較快，每天可達300400nm，逆向傳遞速度約為順向速度的一半。HRP在標記部位有一個聚集的過程，同時HRP運至胞體后被送入溶酶體中水解。因此，需要在聚集及降解兩個相反的過程中求一最佳標記效果時間，約為HRP開始到達標記部位后

25、一天左右。 l（三）動物的固定l動物存活一段時期后，再對動物進行麻醉，用灌注固定法對其進行固定。HRP對固定劑相當敏感，選擇固定液是HRP示蹤方法成功與否的一個關鍵。當初提出HRP方法時用10%甲醛作固定劑，常用1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的混合溶液。戊二醛1963年由Sabotini等介紹用于組織固定后被普遍認為是最好的固定劑之一，多用于保存電鏡標本。它能較完好地固定組織的超微結構，雖對酶有一定程度的破壞作用，但仍有相當程度的酶的活性得以保存下來。其主要缺點是穿透能力太小，如組織塊稍大則其中央部分固定不好，故多在固定液中加入穿透力強的多聚甲醛及采用灌注加浸泡這兩項措施來彌補之。l（四） 取

26、材l灌注后，立取出腦或脊髓，迅速投入上述固定液中后固定6h左右即可作振動切片。若行冰凍切片，將依次移入含10%、20%、30%蔗糖的0.01M磷酸緩沖液（pH7.27.4）中（4OC），直到組織完全下沉后，方可切片。l（五） 切片l 冰凍切片或振動切片，片厚2050m。切片收集于含5%蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液中，pH7.27.4。盡快作呈色反應，否則酶的活行隨時間推移而減弱。l（六） 呈色反應l顯示HRP的方法有多種。最初用二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine,DAB）。以后在光學顯微鏡水平研究 上 ， 多 用 四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 ( 3 , 3 , 5 , 5

27、-tetramethylbenzidine,TMB),因其比DAB更為靈敏，可顯示更多的順行纖維，且無致癌作用。lDAB的氧化產(chǎn)物呈棕色顆粒，在暗視野下反射出金黃色光；TMB氧化產(chǎn)物呈深藍色顆粒，在暗視野下呈橙色。DAB和TMB反應液的pH值要求不同，DAB要求pH6.0，而TMB則為pH3.3，TMB反應產(chǎn)物不如DAB的反應產(chǎn)物穩(wěn)定，在pH7.0溶液中很快消失，但可用重金屬鹽（例如鈷、鎳、鉬、鎢等）穩(wěn)定之。l（六）結果觀察l DAB反應物在神經(jīng)元胞體內呈褐色圓粒，大小及分布較均勻，可擴展至樹突近段內。除顆粒外，胞體內應無其他的棕色染色產(chǎn)物。如用Mesulam的聯(lián)苯胺法或TMB法，HRP之反應

28、顆粒呈藍色，在明視野下清晰可辨。如果反應的顆粒很多，神經(jīng)元的藍色很濃時，用暗視野觀察反而不清楚;但如顆粒較稀，還是暗視野更靈敏。有些標記神經(jīng)元在明視野下僅勉強可辨或幾乎不能分辨，但在暗視野下仍清晰可見。藍色反應的顆粒在暗視野下呈橘黃色。l熒光素追蹤法熒光素追蹤法l熒光染料追蹤法主要用作逆行追蹤。有的染料也可被用于順行追蹤，但標記較弱。熒光染料的種類很多，按熒光染料的標記部位可將它們分為兩類，一類主要標記細胞核，如核黃(nuclear yellow)和diamidino yellow，另一類主要標記細胞漿，如固藍(fast blue)和熒光金(fluoro-gold)，多數(shù)熒光染料屬后者。不同的染料有不