1、第二十二章第二十二章 基因結構與功能分析技術基因結構與功能分析技術 The Analysis Technology for Gene Structure and Function第一節第一節 基因結構分析技術基因結構分析技術 一、基因一級結構解析技術一、基因一級結構解析技術 基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結構最精確的技術就是順序，解析一級結構最精確的技術就是DNA測序（測序（DNA sequencing）。）。 （一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規的（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規的DNA測序方法測序方法 Sanger雙脫氧測序（雙脫氧測

2、序（dideoxy sequencing）法）法 Maxam-Gilbert化學降解測序法化學降解測序法 （二）全自動激光熒光（二）全自動激光熒光DNA測序技術的原理測序技術的原理基于基于Sanger雙脫氧法雙脫氧法 1. 四色熒光法：四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標記同一引物或采用四種不同的熒光染料標記同一引物或4種不同的種不同的終止底物終止底物ddNTP，最終結果均相當于賦予，最終結果均相當于賦予DNA片段片段4種不種不同的顏色。因此，一個樣品的同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產物可在同一個泳個反應產物可在同一個泳道內電泳。道內電泳。2. 單色熒光法：單色熒光法：采用單一熒光染料標記

3、引物采用單一熒光染料標記引物5-端或端或dNTP，所有產物，所有產物的的5-末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產物也必須在四個不同的泳道內電泳必須分別進行，相應產物也必須在四個不同的泳道內電泳（三）焦磷酸測序是一種基于發光法測定焦磷（三）焦磷酸測序是一種基于發光法測定焦磷酸的測序技術酸的測序技術 焦磷酸測序技術操作簡單，焦磷酸測序技術操作簡單，結果準確可靠，可應用于單核結果準確可靠，可應用于單核苷酸多態性位點（苷酸多態性位點（SNP）分析、）分析、等位基因頻率測定、細菌和病等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定

4、、毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關甲基化分析、掃描與疾病相關基因序列中的突變點等領域。基因序列中的突變點等領域。該方法的測序長度一般短于該方法的測序長度一般短于Sanger法。法。 （四）循環芯片測序被稱為第二代測序技術（四）循環芯片測序被稱為第二代測序技術 循環芯片測序（循環芯片測序（cyclic-array sequencing） 可實現大規模并行化分析可實現大規模并行化分析 不需電泳，設備易于微型化不需電泳，設備易于微型化 樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本 優勢：優勢：技術平臺：技術平臺：454測序、測序、Solexa測序

5、（測序（Illumina測序）、測序）、SOLiD測序等。測序等。 基本流程：基本流程： 將基因組將基因組DNA隨機切割成為小片段隨機切割成為小片段DNA； 在所獲小片段在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；后變性得到單鏈模板文庫； 將帶接頭的單鏈小片段將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體文庫固定于固體表面；表面； 對固定片段進行克隆擴增，從而制成對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。芯片。 針對芯片上的針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環反應，通過讀取堿基連接到行一系列循環反應，通過讀取堿基

6、連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。堿基序列。（五）單分子測序技術被稱為第三代測序技術（五）單分子測序技術被稱為第三代測序技術 主要策略：主要策略： 通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現單分通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現單分子測序，如單分子實時技術（子測序，如單分子實時技術（single molecule real time technology，SMRT）；）； 利用利用DNA聚合酶在聚合酶在DNA合成時的天然化學方式合成時的天然化學方式來實現單分子測序；來實現單分子測序； 直接讀取單分子直接讀取單分子DNA序列信息。序列信息。

7、 二、基因轉錄起點分析技術二、基因轉錄起點分析技術 轉錄起點（轉錄起點（transcription start site，TSS） （一）用（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定克隆直接測序法鑒定TSS 以以mRNA為模板，經逆轉錄合成為模板，經逆轉錄合成cDNA第一鏈，同時第一鏈，同時利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，在利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，在cDNA第一鏈的末端第一鏈的末端加上加上polyC尾，并以此引導合成尾，并以此引導合成cDNA第二鏈。將雙鏈第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的的5 -末端進行測末端進行測序分析即可確定基因的序分析即可確

8、定基因的TSS序列。序列。 該方法比較簡單，尤其適于對特定基因該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。的分析。但可導致但可導致5 -末端部分缺失，從而影響對末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。的序列測定。 （二）用（二）用5 -cDNA末端快速擴增技術鑒定末端快速擴增技術鑒定TSS 常用的技術包括常用的技術包括5 -末端基因表達系列分析（末端基因表達系列分析（5 -end serial analysis of gene expression，5 -SAGE）和帽分析基因表達）和帽分析基因表達（cap analysis gene expression，CAGE）技術。）技術。 （三

9、）用數據庫搜索（三）用數據庫搜索TSS 利用對寡核苷酸帽法構建的全長利用對寡核苷酸帽法構建的全長cDNA文文庫庫5 -末端測序所得的數據信息建立了一個末端測序所得的數據信息建立了一個TSS數據庫（數據庫（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術相結合開發了一種法和大量平行測序技術相結合開發了一種TSS測序法，從而實現了一次測試可產生測序法，從而實現了一次測試可產生1107 個個TSS的數據。的數據。 三、基因啟動子結構分析技術三、基因啟動子結構分析技術 （一）用

10、（一）用PCR結合測序技術分析啟動子結構結合測序技術分析啟動子結構 該方法最為簡單和直接，即根據基因的啟動該方法最為簡單和直接，即根據基因的啟動子序列，設計一對引物，然后以子序列，設計一對引物，然后以PCR法擴增啟動法擴增啟動子，經測序分析啟動子序列結構。子，經測序分析啟動子序列結構。 （二）用核酸（二）用核酸-蛋白質相互作用技術分析啟動蛋白質相互作用技術分析啟動子結構子結構 1. 用足跡法分析啟動子中潛在的調節蛋白結合位點用足跡法分析啟動子中潛在的調節蛋白結合位點 足跡法（足跡法（footprinting）是利用）是利用DNA電泳條帶電泳條帶連續性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質結合的連續性中斷的

11、圖譜特點判斷與蛋白質結合的DNA區域，它是研究核酸區域，它是研究核酸-蛋白質相互作用的方法，而蛋白質相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結構的方法。不是專門用于研究啟動子結構的方法。 分類：分類：酶足跡法酶足跡法化學足跡法化學足跡法 （1）用核酸酶進行足跡分析）用核酸酶進行足跡分析 酶足跡法酶足跡法（enzymatic footprinting）是利用是利用DNA酶處理酶處理DNA-蛋白質復合物，然后通過蛋白質復合物，然后通過電泳分析蛋白質結合序列。電泳分析蛋白質結合序列。常用的酶有常用的酶有DNA酶酶I（DNase I）和核酸外切）和核酸外切酶酶III。 （2）用化學試劑進行足跡分析）用

12、化學試劑進行足跡分析 化學足跡法（化學足跡法（chemical footprinting）是利）是利用能切斷用能切斷DNA骨架的化學試劑處理骨架的化學試劑處理DNA-蛋白質蛋白質復合物，由于化學試劑無法接近結合了蛋白質的復合物，由于化學試劑無法接近結合了蛋白質的DNA區域，因此在電泳上形成空白區域的位置區域，因此在電泳上形成空白區域的位置就是就是DNA結合蛋白的結合位點。最常用的化學結合蛋白的結合位點。最常用的化學足跡法是羥自由基足跡法（足跡法是羥自由基足跡法（hydroxyl radical footprinting）。）。 2. 用電泳遷移率變動分析和染色質免疫沉淀技術鑒定用電泳遷移率變動

13、分析和染色質免疫沉淀技術鑒定啟動子啟動子 電泳遷移率變動分析（電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質免）和染色質免疫沉淀（疫沉淀（ChIP）只能確定）只能確定DNA序列中含有核蛋白序列中含有核蛋白結合位點，故尚需結合結合位點，故尚需結合DNA足跡實驗和足跡實驗和DNA測序測序等技術來確定具體結合序列。等技術來確定具體結合序列。 （三）用生物信息學預測啟動子（三）用生物信息學預測啟動子 1. 用啟動子數據庫和啟動子預測算法定義啟動子用啟動子數據庫和啟動子預測算法定義啟動子 在定義啟動子或預測分析啟動子結構時應包括啟在定義啟動子或預測分析啟動子結構時應包括啟動子區域的動子區域的3個部分個部分 核心

14、啟動子（核心啟動子（core promoter）；）； 近端啟動子（近端啟動子（proximal promoter）：含有幾個）：含有幾個調控元件的區域，其范圍一般涉及調控元件的區域，其范圍一般涉及TSS上游幾百個堿基；上游幾百個堿基； 遠端啟動子（遠端啟動子（distal promoter）：范圍涉及）：范圍涉及TSS上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。 2. 預測啟動子的其他結構特征預測啟動子的其他結構特征 啟動子區域的其他結構特征包括啟動子區域的其他結構特征包括GC含量、含量、CpG比比率、轉錄因子結合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。率、

15、轉錄因子結合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。 用于啟動子預測的數據庫：用于啟動子預測的數據庫：EPD（eukaryotic promoter databases）數據庫，主要預測真核）數據庫，主要預測真核RNA聚合聚合酶酶型啟動子，數據庫中的所有啟動子數據信息都經過型啟動子，數據庫中的所有啟動子數據信息都經過實驗證實；實驗證實；TRRD（transcription regulatory region databases）是一個轉錄調控區數據庫，數據來源于已發）是一個轉錄調控區數據庫，數據來源于已發表的科學論文。表的科學論文。 四、基因編碼序列分析技術四、基因編碼序列分析技術 （一）用（一）用

16、cDNA文庫法分析基因編碼序列文庫法分析基因編碼序列 cDNA克隆測序或構建克隆測序或構建cDNA文庫是最早分析基因文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長編碼序列的方法。全長cDNA文庫可以通過文庫可以通過mRNA的結的結構特征進行判斷，構特征進行判斷，mRNA的序列基本都由的序列基本都由3部分組成，部分組成，即即5 -UTR、編碼序列和、編碼序列和3 -UTR。 cDNA末端快速擴增（末端快速擴增（RACE）技術是高效釣取未）技術是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從核酸雜交法可從cDNA文庫中獲得特定基因編碼序文庫中獲得特定基因編碼序列的列的cDNA

17、克隆?？寺　＃ǘ┯茫ǘ┯肦NA剪接分析法確定基因編碼序列剪接分析法確定基因編碼序列 高通量分析高通量分析RNA剪接的方法：剪接的方法： 基于基于DNA芯片的分析法芯片的分析法 交聯免疫沉淀法交聯免疫沉淀法 體外報告基因測定法體外報告基因測定法選擇性剪接的轉錄產物可以通過基因表達序選擇性剪接的轉錄產物可以通過基因表達序列標簽（列標簽（expression sequence tag, EST）的比較）的比較進行鑒定，但這種方法需進行大量的進行鑒定，但這種方法需進行大量的EST序列測序列測定；同時由于大多數定；同時由于大多數EST文庫來源于非常有限的文庫來源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異

18、體也很可能丟失。組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。 （三）用數據庫分析基因編碼序列（三）用數據庫分析基因編碼序列在基因數據庫中，對各種方法所獲得的在基因數據庫中，對各種方法所獲得的cDNA片段的片段的序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內含子序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內含子外顯外顯子分析、子分析、ORF分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對其編碼產物的基本性質進行分析。編碼序列，并可對其編碼產物的基本性質進行分析。利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然

19、后，利用因序列，然后，利用NCBI的的ORF Finder軟件或軟件或EMBOSS中的中的getorf軟件進行軟件進行ORF分析，并根據編碼序列和非編碼序分析，并根據編碼序列和非編碼序列的結構特點，便可確定基因的編碼序列。列的結構特點，便可確定基因的編碼序列。 五、基因拷貝數分析技術五、基因拷貝數分析技術 分析某種基因的種類及拷貝數，實質上就是對分析某種基因的種類及拷貝數，實質上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術包括基因進行定性和定量分析，常用的技術包括DNA印跡（印跡（Southern印跡）、實時定量印跡）、實時定量PCR技術等。技術等。 DNA印跡是根據探針信號出現的位置和次數印跡是

20、根據探針信號出現的位置和次數判斷基因的拷貝數判斷基因的拷貝數 實時定量實時定量PCR是通過被擴增基因在數量上的差是通過被擴增基因在數量上的差異推測模板基因拷貝數的異同異推測模板基因拷貝數的異同DNA測序是最精確的鑒定基因拷貝數的方法測序是最精確的鑒定基因拷貝數的方法第二節第二節 基因表達產物分析技術基因表達產物分析技術 一、通過檢測一、通過檢測RNA而在轉錄水平分析而在轉錄水平分析基因表達基因表達 根據分析方法的原理和功能特性，可將基因根據分析方法的原理和功能特性，可將基因轉錄水平分析分為封閉和開放性系統研究方法。轉錄水平分析分為封閉和開放性系統研究方法。 封閉性系統研究方法（如封閉性系統研究

21、方法（如DNA芯片、芯片、RNA印跡、實時印跡、實時RT-PCR等）的應用范圍僅限于已知等）的應用范圍僅限于已知基因。開放性系統研究方法（如差異顯示基因。開放性系統研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等）可用于發現和分析未知基因。指紋分析等）可用于發現和分析未知基因。 （一）用核酸雜交法檢測（一）用核酸雜交法檢測RNA表達水平表達水平 1. 用用RNA印跡分析印跡分析RNA表達表達 RNA印跡被廣泛應用于印跡被廣泛應用于RNA表達分析，并表達分析，并作為鑒定作為鑒定RNA轉錄本、分析其大小的標準方法。轉錄

22、本、分析其大小的標準方法。 2. 用核糖核酸酶保護實驗分析用核糖核酸酶保護實驗分析RNA水平及其剪接情況水平及其剪接情況 RNA酶保護實驗（酶保護實驗（ribonuclease protection assay，RPA）是一種基于雜交原理分析）是一種基于雜交原理分析RNA的方的方法，既可進行定量分析，又可研究其結構特征。法，既可進行定量分析，又可研究其結構特征。 3. 用原位雜交進行用原位雜交進行RNA區域定位區域定位 原位雜交（原位雜交（ISH）是通過設計與目標）是通過設計與目標RNA堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測在組織原位檢測

23、RNA的技術，其可對細胞或組的技術，其可對細胞或組織中原位表達的織中原位表達的RNA進行區域定位，同時也可進行區域定位，同時也可作為定量分析的補充。作為定量分析的補充。 （二）用（二）用PCR技術檢測技術檢測RNA表達水平表達水平 1. 用逆轉錄用逆轉錄PCR進行進行RNA的半定量分析的半定量分析 逆轉錄逆轉錄PCR（RT-PCR）一般用于）一般用于RNA的的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。樣品進行半定量分析。2. 用實時定量用實時定量PCR進行進行RNA的定量分析的定量分析 實時定量實時定量PCR是定量分析是定量分析RNA

24、的最通用、的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應反應進行實時監測，具有很高的靈敏度和特異性。進行實時監測，具有很高的靈敏度和特異性。 （三）用基因芯片和高通量測序技術分析（三）用基因芯片和高通量測序技術分析RNA表達水平表達水平 1. 基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法 基因芯片主要采用基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于對不同狀態下芯片，其便于對不同狀態下的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組差異表達的規律，對的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組差異表達的規律，對探索發病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意探

25、索發病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。義。 2. 用循環芯片測序技術分析基因表達譜用循環芯片測序技術分析基因表達譜 運用循環芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通量運用循環芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列分子片段的序列測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌。測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌。 二、通過檢測蛋白質二、通過檢測蛋白質/多肽而在翻譯水平多肽而在翻譯水平分析基因表達分析基因表達 （一）用蛋白質印跡技術檢測蛋白質（一）用蛋白質印跡技術檢測蛋白質/多肽多肽 （二）用酶聯免疫吸附實驗分

26、析蛋白質（二）用酶聯免疫吸附實驗分析蛋白質/多肽多肽 酶聯免疫吸附實驗（酶聯免疫吸附實驗（ELISA）也是一種建立）也是一種建立在抗原在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質抗體反應基礎上的蛋白質/多肽分析方法，多肽分析方法，其主要用于測定可溶性抗原或抗體，其主要用于測定可溶性抗原或抗體， （三）用免疫組化實驗原位檢測組織（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達細胞表達的蛋白質的蛋白質/多肽多肽 免疫組化實驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實免疫組化實驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織/細胞原位對細胞原位對目標抗原（目標蛋白

27、質目標抗原（目標蛋白質/多肽）進行定性、定量、定位檢測。多肽）進行定性、定量、定位檢測。 （四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質的陽（四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質的陽性細胞性細胞 流式細胞術（流式細胞術（flow cytometry）通常利用熒光標記抗）通常利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合，經流式細胞儀分析熒光信號，體與抗原的特異性結合，經流式細胞儀分析熒光信號，根據細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞根據細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞做出判斷。做出判斷。 （五）用蛋白質芯片和雙向電泳高通量分析蛋（五）用蛋白質芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質白質/多肽表達水平多肽表達

28、水平 1. 用蛋白質芯片分析蛋白質用蛋白質芯片分析蛋白質/多肽的表達譜多肽的表達譜 根據制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質檢測和根據制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質檢測和功能芯片兩大類。蛋白質檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯功能芯片兩大類。蛋白質檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質蛋白質蛋白蛋白質質-DNA蛋白質蛋白

29、質-RNA，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、蛋白質酶與底物、蛋白質-小分子等的相互作用。小分子等的相互作用。 蛋白質芯片可用于檢測組織蛋白質芯片可用于檢測組織細胞來源的樣細胞來源的樣品中蛋白質的表達譜；其精確程度、信息范疇品中蛋白質的表達譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。取決于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用雙向電泳分析蛋白質用雙向電泳分析蛋白質/多肽表達譜多肽表達譜 雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質，雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質，對差異表達的蛋白質進行鑒定。對差異表達的蛋白質進行鑒定。 第三節第三節 基因的生物學功

30、能鑒定技術基因的生物學功能鑒定技術一、用功能獲得策略鑒定基因功能一、用功能獲得策略鑒定基因功能 基因功能獲得策略的本質是將目的基因直基因功能獲得策略的本質是將目的基因直接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能?；瘉硌芯炕蚬δ?。 方法：方法： 轉基因技術轉基因技術基因敲入技術基因敲入技術 （一）用轉基因技術獲得基因功能（一）用轉基因技術獲得基因功能 轉基因技術（轉基因技術（transgenic technology）是指將外源基因導入）是指將外源基因導入受精卵

31、或胚胎干細胞（受精卵或胚胎干細胞（embryonic stem cell），即），即ES細胞，通過細胞，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體隨機重組使外源基因插入細胞染色體DNA，隨后將受精卵或，隨后將受精卵或ES細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。傳給后代。 轉基因動物（轉基因動物（transgenic animal）是指應用轉基因技術培）是指應用轉基因技術培育出的攜帶外源基因，并能穩定遺傳的動物，其制備步驟主育出的攜帶外源基因，并能穩定遺傳的動物，其制備步驟主要包括轉基因表達載體的構建、外源基因的導入和鑒

32、定、轉要包括轉基因表達載體的構建、外源基因的導入和鑒定、轉基因動物的獲得和鑒定、轉基因動物品系的繁育等。轉基因基因動物的獲得和鑒定、轉基因動物品系的繁育等。轉基因小鼠最為常見。小鼠最為常見。 （二）用基因敲入技術獲得基因的功能（二）用基因敲入技術獲得基因的功能 基因敲入基因敲入（gene knock-in）是通過同源重組）是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因，或將一個設的方法，用某一基因替換另一基因，或將一個設計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達并發揮作用。表達并發揮作用。通過基因敲入可以研究特定基因在體內的功通過基因敲入可以研究特定

33、基因在體內的功能；也可以與之前的基因的功能進行比較；或將能；也可以與之前的基因的功能進行比較；或將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。基因治療的目的。 基因敲入基因敲入是基因打靶（是基因打靶（gene targeting）技術）技術的一種。的一種?；虼虬谢虼虬惺且环N按預期方式準確改造生是一種按預期方式準確改造生物遺傳信息的實驗手段。除基因敲入外，基因打物遺傳信息的實驗手段。除基因敲入外，基因打靶還包括靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體基因敲除、點突變、缺失突變、染色體大片段刪除大片段刪除等。等?；虼虬信c轉基因技術均可

34、用于基因功能研基因打靶與轉基因技術均可用于基因功能研究，但二者的究，但二者的最大區別最大區別就是基因打靶能去除和就是基因打靶能去除和/或或替換生物體內的固有基因，而轉基因技術則未去替換生物體內的固有基因，而轉基因技術則未去除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究基因功能最直接和最有效的方法之一?；蚬δ茏钪苯雍妥钣行У姆椒ㄖ弧?二、用功能失活策略鑒定基因功能二、用功能失活策略鑒定基因功能 基因功能失活策略的本質是將細胞或個體基因功能失活策略的本質是將細胞或個體的某一基因功能部分或全部失活后，通過觀察的某一基因功能部分或全部失活后，通過觀察細胞生物學行為或個體遺傳性狀表型的變化來細胞生物學行為或個體遺傳性狀表型的變化來鑒定基因的功能。鑒定基因的功能。 方法：方法： 基因敲除基因敲除基因沉默基因沉默 基因敲除基因敲除（gene knock-out）屬于基因打靶技術的一）屬于基因打靶技術的一種，其利用同源重組的原理，在種，其利用同源重組的原理，在ES細胞中定點破壞內源細胞中定點破壞內源基因，然后利用基因，然后利用ES細胞發育的全能性，獲得帶有預定基細胞發育的全能性，獲得帶有