1、枯草芽抱桿菌的分離及篩選微生物設計性實驗枯草芽抱桿菌的分離及篩選1實驗目的掌握枯草芽抱桿菌的分離篩選的基本原理，熟練掌握無菌接種技術、微生物分離篩選技術和微生物形態觀察技術。了解枯草芽抱桿菌的分布、營養、生長等特點，以及它所具有的產淀粉酶的功能。根據這些特點進行分離和篩選，從而得到純菌株。2實驗原理枯草芽抱桿菌屬革蘭氏陽性菌，芽抱0.60.9X.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養基中生長時，常形成皺酸。需氧菌。有的菌株是淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產菌；有的菌株具有強烈降解核甘酸的酶系。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中

2、，易在枯草浸汁中繁殖，故名。選擇含淀粉豐富的土壤為最佳，80度的水浴處理樣品1小時，目的是殺死微生物營養體，殘留芽胞。利用稀釋涂步法，在淀粉的培養基培養，培養1-3天后，觀察。然后，進行初篩與純化，鑒定參照伯杰氏細菌手冊鑒定或者利用顯微鏡進行革蘭氏染色，確認是否為枯草芽抱桿菌。再復篩，測定其淀粉酶活，最后確定菌株。3實驗材料3.1 選擇培養基本次實驗進行產淀粉酶的枯草芽抱桿菌的篩選，所以應選淀粉培養基。配方:牛肉膏5.0g蛋白陳10.0g氯化鈉5.0g可溶性淀粉10.0g瓊脂20g蒸儲水1000ml調整pH至7.2配置時應先把淀粉用少量蒸儲水調成糊狀，再加入到融化好的培養基中。3.2 溶液或試

3、劑牛肉膏1.25g蛋白陳2.5g氯化鈉1.25g可溶性淀粉2.5g瓊脂5g碘11克，碘原液2毫升，碘化鉀42克，可溶性淀粉2克，磷酸氫二鈉45.23克，檸檬酸8.068克，氯化鉆25克，重銘酸鉀3.34克，100毫升0.01NHCL。3.4 儀器或其他用品平板培養皿10個、試管15支、三角瓶2個、燒杯3個、稱量紙、高壓蒸汽滅菌鍋、干燥箱、包溫培養箱、超凈工作臺、無菌涂布器、電熱恒溫水浴、500ml量筒、顯微鏡、無菌吸管、無菌培養皿、無菌刻度吸管、酒精燈、記號筆、火柴、試管架、接種鉤、滴管等。4實驗流程倒平板一制備梯度稀釋液一涂布一培養一初篩一復篩一純化一保存5實驗步驟實驗前準備制備淀粉培養基，

4、無菌水，在121攝氏度下滅菌20min。倒平板。把接種工具，培養基，和其他用品全部在超凈工作臺上擺好，進行紫外線滅菌30min。5.1 制備土壤稀釋液取土樣時最好選取如花壇等地方的土樣，選好采樣地點，鏟產去表層5cm,取515cm處。用無菌器具規范采樣幾十克，裝入無菌的塑料袋或紙袋中扎好，記錄采樣時間、地點、采樣環境等以備考證。采樣后應盡快分離。振搖約二十分鐘，使土樣與水充分混合，將細胞分散。放入盛有99ml無菌水三角瓶中，常壓80度的水浴處理樣品1小時后，取出。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9m

5、l無菌水的試管中，混合均勻，以此類推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的土壤溶液。5.2 涂布將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-3、10-4、10-5三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-3、10-4、10-5三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml,小心地滴在對應平板培養基表面中央位置。用無菌涂布器涂布。右手拿無菌涂布器平放在平板培養基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置510min,使菌液浸入培養基。5.3 培養將淀粉培養基平板倒置于30C培養箱中培養13d。5.4 初篩觀察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黃色，將這樣的菌種單

6、個菌落分別挑取少許細胞接種到培養基上，置于30的培養箱中培養，若發現有雜菌，需要再一次進行分離純化。(如不能用肉眼更好的觀察，可對其進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，與標準菌種比較。)5.8 復篩測定其淀粉酶活。5.8.1 試劑和器材1、試劑：(1)碘原液：稱取碘11克，碘化鉀22克，加水溶解，稀釋至500毫升。(2)稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化鉀20克，稀釋至500毫升，此試劑隨配隨用。(3) 2%淀粉液：稱取干燥過的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸儲水，攪拌混和，冉徐徐傾入70毫升煮沸的蒸儲水中。繼續煮沸2分鐘，冷卻至室溫，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH為6)(4)檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二

7、鈉(N&HPO412H2O)45.23克，檸檬酸(C6H8。7H2O)8.068克，加水溶解，稀釋至1000毫升。(5)標準比色液：稱取氯化鉆(C0CL2-6H2O)25克和重銘酸鉀3.34克溶于100毫升0.01NHCL,其五倍稀釋作標準。(6)樣品：細菌-a淀粉酶2、器材(1)電熱恒溫水浴(2)試管(3)量筒(4)吸量管(1ml)5.8.2 操作方法：1、取試管1支，力口20毫升2%淀粉，混勻，在30c水浴中，使管內溫度達到30C。2、將淀粉酶0.5ml加到30c的淀粉液中，混勻，在30c水浴中保溫，自加入記時，經5分鐘后取反應液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的試管中。混勻，目測比色

8、，每隔一定時間重復測定，直至呈色與標準比色顏色相同為止，記錄反應進行的時間。3、計算。在上述條件下，每一小時催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定為一個酶活力單位。5.9 純化并保存菌種保存時一般都需要不受雜菌污染，菌種變異很少，并能盡量保持細菌的形態和生理性狀不發生變化。同時，做好以下工作：(1)做好菌種保存記錄，注明菌種名稱，分離年月日、分離者姓名、分離地點等。(2)防止雜菌污染及意外事故，把菌種保存在23只試管中備用。(3)原始菌種妥善保存。6結果與分析6.1 分離到枯草芽抱桿菌菌的株數6.2 枯草芽抱桿菌產酶活性大小及形態觀察鑒定結果【注明參考文獻，格式參考學術論文樣式】枯草芽抱桿菌的

9、鑒定實驗1、形態的觀察(形狀、顏色、質地、透明度等)(1)單個菌體的形態(2)群體形態的觀察2、革蘭氏染色3、芽抱染色4、菌體大小測量5、枯草芽抱桿菌的生理生化鑒定:、過氧化氫酶測定1、原理：過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成水和氧2、試劑：310%過氧化氫:肉湯瓊脂培3、操作步驟：將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，30培養12天。取一干凈載玻片，在上面加一滴310%的過氧化氫，挑取一環培養12天的菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡(氧氣)出現，記作過氧化氫酶陽性,無氣泡者為陰性。也可將液直接加入斜面上，觀察氣泡的產生。二、需氧性試驗1、原理：不同種類的芽抱桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可

10、作為鑒定芽抱桿菌的一個較重要指標。2、培養基：半固體培養基3、操作步驟：用一小環的肉湯菌液穿刺接種到上述培養基中（必須穿刺到管底），一般于30培養3-7天觀察結果。若芽抱桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌三、乙酰甲基甲醇實驗1、原理：本實驗是測定芽抱桿菌（或其他細菌）發酵葡萄糖的變化。有些芽抱桿菌發酵葡萄糖產酸，并將產生的酸進一步轉化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇或的“瓜基起作用，生成紅色化合物，即表示2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在堿性環境中可被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，后者與蛋白陳中精氨酸所含V.P.試驗陽性。若在培養基中加入少量肌酸以補充胴基，可加速反應。反

11、應式如下：2丙酮酸一乙酰甲基甲醇+2二氧化碳；-2H乙酰甲基甲醇二乙酰；+KOH縮合二乙酰+NH=C（NH2）2紅色化合物2、培養基和試劑培養基：蛋白陳5g,葡萄糖5g,NaCl5g,蒸儲水1000ml。調節PH6.5,每管分裝45ml,0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌試劑：3、步驟：1.接種與培養將芽抱桿菌測試菌接種于上述培養液中，一般于30攝氏度培養4天。2.結果觀察在培養4天后，取培養液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，如少量肌酸（約0.51mg）,充分振蕩，25min后如培養液呈紅色，即為V.P.試驗陽性，有時須放置更長時間才出現紅色反應。四、淀粉水解1、原理：許多芽抱桿菌產生淀粉酶，能將培養基中的淀粉水解成無色糊精等小分子物質或進一步水解為麥芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。2、培養基及試劑：培養基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa（15lbf/in2）20min滅菌備用。試劑：3、步驟：將培養基融化后，冷卻至50攝氏度左右，倒成平板，凝固后取菌種點鐘于平板上（每皿點鐘2點），一般于30攝氏度培養2-4天,形成菌落后，在平板上滴加盧哥爾氏碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有五色透明圈出現，說明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。盧哥爾氏碘液40%NAOH（或KOH）