1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標準DB53/T 1064.12021綠孔雀檢疫技術第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范Quarantine technique for Pavo muticusPart 1: Technical specifications for laboratory examination of avian paramyxoviruses2021 - 09 - 30 發布2021 - 10 - 14 實施云南省市場監督管理局發 布學兔兔 標準下載DB53/T 1064.12021目次前言III引言I1 范圍12 規范性引用文件13 術語和定義14

2、縮略語25 總則26 儀器設備和試劑26.1 實驗室設備26.2 試劑37 樣品37.1 采樣要求與原則37.2 采集工具37.3 樣品類型與采樣方法37.4 采樣登記表的填寫47.5 樣品的保存和運輸48 試驗步驟48.1 雞胚接種（病毒分離）48.2 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗48.3 禽副黏病毒 L 和 M 基因的 RT-PCR 擴增58.4 新城疫病毒 F 基因的 RT-PCR 擴增及測序分析69 試驗數據處理79.1 HA 試驗結果判定79.2 HI 試驗結果判定79.3 L 和 M 基因擴增結果判定79.4 F 基因擴增結果及毒力判定7附錄 A（規范性）試劑配制8附

3、錄 B（規范性）采樣記錄表10附錄 C（規范性）RT-PCR 引物11IDB53/T 1064.12021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則的規定起草。本文件DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術的第1部分。DB53/T 1064已經發布了以下部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術規范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術規范。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。 本文件由云南省林業與草原局、云南省市場監督管理局

4、共同提出。本文件由云南省林業標準化技術委員會（YNTC02）歸口。 本文件主要起草單位：云南農業大學、云南省標準化研究院。本文件主要起草人：陳培富、黃艷梅、胡世享、楊敏、卓娜、李寧、錢麗敏、鄒豐才、何依蓉、楊建發。IIIDB53/T 1064.12021引言綠孔雀（Pavo muticus）在我國僅分布于云南，是國家級重點保護野生動物，也是全球瀕危物種， 并已列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)和世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄。為切實貫徹中華人民共和國野生動物保護法和中華人民共和國動物防疫法，編制并發布DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術地方標準，可讓從事綠孔雀保護的相關人員按標準

5、化和規范化程序開展綠孔雀病原學診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀的成活率，維護綠孔雀種群健康和地區生態平衡， 提升生物多樣性保護成效。本文件已發布4個部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范。本部分從禽副黏病毒實驗室檢測技術的總則、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范。本部分從禽流感病毒實驗室檢測技術的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方 面制定了規范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術規范。本部分從羽虱實驗室檢測的原理、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試

6、驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術規范。本部分從消化道線蟲實驗室檢測技術的試驗原理、常見線蟲形態特征、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范。DB53/T 1064.12021綠孔雀檢疫技術第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范重要提示：本檢測技術規范中，氯仿有中等毒性，操作時應在通風條件下進行并戴手套和口罩，不小心接觸皮膚應立即沖洗；凝膠電泳若使用溴化乙啶（EB）作核酸染色劑，操作時應戴手套和口罩，被EB污染的物品要進行無害化處理；操作焦碳酸二乙酯（DEPC）應戴手套和口罩并在通風條件下，不小心接觸皮膚應立即沖洗。

7、由于新城疫病毒可引起人一過性結膜炎，采樣及檢測人員應佩戴口罩和防護眼鏡， 并采取必要的消毒措施。本文件中凡接觸病毒樣品的檢驗器材、廢棄物及其包裝物均應做消毒或滅菌無害化處理，以免污染環境或擴散病毒。1 范圍本文件規定了綠孔雀（Pavo muticus）檢疫技術中禽副黏病毒實驗室檢測技術涉及的總則、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟和試驗數據處理。本文件適用于綠孔雀檢疫技術中禽副黏病毒實驗室檢測。2 規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，標注日期的引用文 件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不標注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適 用于本文

8、件。NY/T 541 獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范NY/T 1948 獸醫實驗室生物安全要求通則3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1禽副黏病毒 avian paramyxoviruses一類感染家禽和野禽的單鏈負股RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），包括至少禽副黏病毒19血清型，其中禽副黏病 毒1型又稱作新城疫病毒（Newcastle disease virus），其致病性最受關注。3.2F 蛋白酶切位點 cleavage site of F protein新城

9、疫病毒融合蛋白（F）的F2亞基（位于F氨基端）與F1亞基（位于F羧基端）之間被宿主細胞蛋白內切酶識別的一個短肽，由113117位氨基酸殘基組成，其中113116位可能含多個堿性氨基酸，如精氨酸（R）或賴氨酸（K）。3.3病毒血凝試驗 viral hemagglutination test1DB53/T 1064.12021利用有血凝活性的病毒與特定動物的紅細胞結合而使紅細胞凝集（即紅細胞不再自然下沉匯集）的 特性，測定病毒效價即滴度的方法。3.4病毒血凝抑制試驗 viral hemagglutination inhibition test使用抗體阻斷或抑制病毒的血凝活性，用于測定血清抗體效價或

10、病毒種類的一種方法。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。AMV：禽成髓細胞瘤病毒 Avian myeloblastosis viruscDNA： 互 補 DNA complementary DNA DEPC：焦碳酸二乙酯 DiethypyrocarbonatedNTP：脫氧核苷酸 Deoxyribonucleotide triphosphate EB：溴化乙啶 Ethidium bromideF：融合蛋白 Fusion protein HA：血凝 HemagglutinationHAU：血凝單位 Hemagglutination unit HI：血凝抑制 Hemagglutination inh

11、ibition L：大聚合酶蛋白 Large polymerase protein M：基質蛋白 Matrix proteinNDV： 新 城 疫 病 毒 Newcastle disease virus PBS：磷酸緩沖鹽溶液 Phosphate-buffered saline PCR：聚合酶鏈式反應 Polymerase chain reaction RBCs：紅細胞 Red blood cellsRNA：核糖核酸 Ribonucleic acidRT-PCR：反轉錄-聚合酶鏈式反應 Reverse-transcription polymerase chain reaction SPF：無特

12、定病原體 Specific pathogen free5 總則5.1 采用雞胚接種方法從綠孔雀檢測樣品分離禽副黏病毒。5.2 取5.1得到的雞胚尿囊液做病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗，確定分離毒株的種屬和血清型（亞型）。5.3 用RT-PCR擴增分離毒株的RNA聚合酶（L）基因和基質蛋白（M）基因，對禽副黏病毒及其第1 血清型（新城疫病毒）分別做出鑒定。5.4 對5.2或5.3確定的新城疫病毒分離株，采取RT-PCR擴增其融合蛋白（F）基因，再做測序分析， 對新城疫病毒分離株做出毒力判定。6 儀器設備和試劑6.1 實驗室設備6.1.1 PCR 儀：溫度范圍 4.0 99.9 ，樣品

13、基座配置至少包括單個 0.2 mL 孔。2DB53/T 1064.120216.1.2 凝膠成像系統：對 EB 染色的 DNA 檢測靈敏度低至 0.1 ng；有效像數 1 360×1 024、10 bit，數據線接口 USB 2.0。6.1.3 冷凍高速離心機：最高離心力 20 000 g；容量 1.5 mL × 12。6.1.4 電泳儀：電壓 50 V120 V，電流 10 mA800 mA，定時 0min999min。6.1.5 電泳槽：耐高溫、耐腐蝕、不漏液；緩沖液新鮮且容量充足。6.1.6 冰箱：具有冷藏和冷凍功能分區（20 4 ）。6.1.7 微量移液器：單道可調

14、，量程 0.5 L10 L、2 L20 L、10 L100 L 和 100 L1 000 L。6.1.8水浴鍋：溫度范圍 20 100 。6.1.9 過濾器：一次性無菌用品，內含孔徑 0.45 m 的濾膜。6.1.10 V 形孔血凝反應板：一次性或可重復使用的血凝反應板。6.2 試劑6.2.1 阿氏液（Alsever's Solution），pH 7.2、0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、1%健康未免疫雞紅細胞懸液、標準新城疫病毒抗原、陽性對照血清和陰性對照血清。6.2.2 RNA 提取試劑盒、氯仿、異丙醇、75%乙醇、1.0%瓊脂糖凝膠、50×TAE 緩沖液、

15、10 g/L 溴化乙啶（EB）或其他可替代的核酸染料、DNA 分子量標準、2×Taq Master Mix、無 RNA 酶滅菌超純水（DEPC 處理水）、10×擴增反應緩沖液、dNTPs、RNase 抑制劑（40 U/L)、AMV 反轉錄酶（5 U/L）、膠回收試劑盒。6.2.3 試劑配制見附錄 A。7 樣品7.1 采樣要求與原則7.1.1 采樣應符合 NY/T 541 的要求。7.1.2 采集的樣品具有代表性，應從瀕死、死禽和處于急性發病期的綠孔雀采集樣品，對暴發疫病的 群體宜采集多只發病或死亡個體的樣品，采樣過程應無菌操作，容器應密封，注意避免被污染。7.2 采集工具棉

16、拭子、剪刀、鑷子、1.5 mL離心管、研缽等采樣工具經121 、20min高壓滅菌并烘干。7.3 樣品類型與采樣方法7.3.1 組織樣品取病死孔雀待檢樣品，采集肺臟（或氣管）、腦、心、肝、脾、胃、腎等組織各1份，每份不少于3 g，置于潔凈樣品袋或平皿內。將樣品封口貼上標簽，做好標記。7.3.2 拭子樣品7.3.2.1 取待檢樣品，采集喉氣管拭子和泄殖腔拭子（或新鮮糞樣）各 1 份，將拭子樣品端剪下或折斷，分別置于無菌試管或器皿中，加 1.0 mL1.5 mL 含抗生素的 PBS。將樣品封口，貼上標簽，做好標記。7.3.2.2 抗生素含量視具體情況而定：a) 對氣管拭子，PBS 應含青霉素（1

17、000 U/mL）、鏈霉素（1 mg/mL）或卡那霉素（50 g/mL） 和制菌霉素（1 000 U/mL）；3DB53/T 1064.12021b) 對泄殖腔拭子和糞便 PBS，上述抗生素濃度應提高至 5 倍。7.3.3 血清樣品采集靜脈血液2 mL3 mL于無菌離心管中，自然放置析出血清，3 000 r/min離心10min，將血清轉移、分裝于新的無菌試管中，蓋緊蓋子，封好口，貼上標簽。不同個體的血清樣品不能混合。7.3.4 整只采樣將病死孔雀裝入封閉的無毒塑料袋內，至少用兩層塑料袋包裝，封口并貼上標簽，作好標記。7.4 采樣登記表的填寫填寫采樣記錄表（見附錄B），樣品編號應與標簽一致，隨

18、樣品送至符合NY/T 1948要求的實驗室。7.5 樣品的保存和運輸7.5.1 樣品應置于加干冰或冰袋的保溫瓶或隔熱泡沫盒中運輸，也可用液氮罐運輸，保溫容器應密封， 防止滲漏。保溫容器外貼封條，封條有貼封人（單位）簽字或蓋章，并注明貼封日期。7.5.2 所有樣品在 4 以下運輸，拭子樣品和組織樣品應作暫時的冷藏（4 ）或冷凍（20 ）處理，隨即送至實驗室。7.5.3 血清樣品宜單獨存放。若 24 h 內可運達實驗室，在保溫箱內加冰袋冷藏運輸；若超過 24 h，應先冷凍，其后在保溫箱內加大量冰袋運輸，途中不能超過 48 h。7.5.4 各種樣品到達實驗室后，若暫時不進行處理，則應冷凍（20 以下

19、）保存，不應反復凍融。8 試驗步驟8.1 雞胚接種（病毒分離）8.1.1 樣品處理將棉拭子在PBS中充分混勻至拭子上沒有肉眼可見的樣品；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研磨，按照1 g 組織加10 mL PBS的比例混成懸液。樣品液經3 000 r/min離心10min，取上清液用濾器過濾， 再取濾過液作為接種材料。8.1.2 樣品接種取按8.1.1處理完畢的樣品，以0.2 mL/胚的量經尿囊腔途徑接種孵化9 d11 d的SPF雞胚，每個樣品接種35枚雞胚，在37 孵化箱內孵育，每天上午和下午定點觀察雞胚死亡情況。無菌收集24 h 96 h 死亡雞胚及96 h仍存活雞胚的尿囊液，用于病毒血凝試

20、驗以測定有無HA活性。8.2 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗8.2.1 病毒血凝（HA）試驗8.2.1.1 在 96 孔 V 型微量反應板，每孔預先加 25 L PBS。8.2.1.2 向第 1 孔加入 25 L 尿囊液，反復吹吸 3 次5 次混勻。8.2.1.3 從第 1 孔吸取 25 L 溶液加入第 2 孔，混勻后吸取 25 L 加入第 3 孔，如此進行 2 倍連續稀釋至第 11 孔，從第 11 孔吸取 25 L 溶液棄去，但第 12 孔加入 25 L PBS 或正常尿囊液作為陰性對照孔。4DB53/T 1064.120218.2.1.4 每孔加入 25 L PBS。8.2.1

21、.5 每孔加入 25 L 1%雞紅細胞懸液。8.2.1.6 輕輕振蕩血凝反應板以混勻反應體系，室溫（20 25 ）靜置 40min，或 4 靜置 60min， 當陰性對照孔的紅細胞在孔底匯集成原點時判定結果。8.2.2 病毒血凝抑制（HI）試驗8.2.2.1 在 96 孔血凝反應板，每孔預先加入 25 L PBS。8.2.2.2 向第一孔加入 25 L 血清樣品，混勻。8.2.2.3 在血凝反應板上將血清作橫向的 2 倍連續稀釋，但第 12 孔、第 13 孔、第 14 孔和第 15 孔分別設置為加 25 L PBS 的紅細胞對照孔、加未做任何免疫禽血清的陰性對照孔、加禽流感病毒抗體的對照孔和加

22、禽腺病毒抗體的對照孔（對已確定禽副黏病毒血清型的分離毒株，還可設置陽性對照孔）。8.2.2.4 每孔加入 25 L 4 HAU 的病毒抗原，室溫（20 25 ）靜置不少于 30min，或 4 靜置不少于 60min。8.2.2.5 每孔加入 25 L 1%RBCs，輕輕振蕩混勻，室溫（20 25 ）靜置約 40min，或 4 放置約 60min，當紅細胞對照孔呈顯著鈕扣狀時判定結果。8.3 禽副黏病毒 L 和 M 基因的 RT-PCR 擴增8.3.1 病毒 RNA 的提取可用商品化 RNA 提取試劑盒提取待檢樣品（棉拭子、組織或雞胚尿囊液）、陽性對照樣品及陰性對照樣品的病毒 RNA。也可用 R

23、NA 提取試劑（如 Trizol）提取，方法如下：a) 將經過預處理的 250 L 待檢樣品加入 750 L RNA 提取試劑（如 Trizol）中，振蕩 2min，室溫放置 5min；b) 加入250 L 氯仿，在微量振蕩器上振蕩1min，室溫放置5min 后，4 、12 000 r/min（約14 000×g）離心 15min；c) 吸取上層水相轉入一新的離心管中，加入等量的異丙醇，混勻，室溫放置 15min，4 、12 000 r/min（約 14 000×g）離心 15min；d) 小心吸棄上清，加入 DEPC 處理的 75 %乙醇 750 L，4 、12 000

24、r/min （約 14 000×g）離心5min；e) 小心吸棄上清，將沉淀自然風干或于 50 干燥箱中晾干，加適量的 DEPC 處理水溶解；f) 取 5 L 提取物與 1 L 6×核酸上樣緩沖液混勻，做 1%瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 提取效果， 對組織樣品觀測到 28S、18S 及 5.8S rRNA 三個條帶或至少前兩個條帶，提示 RNA 提取合格；g) 提取的 RNA 應在 2 h 內進行 RT 或 RT-PCR 擴增，若需長期保存 RNA，應置于80 冰箱或液氮內。8.3.2 RT-PCR 擴增（兩步法）8.3.2.1 反轉錄反應（cDNA 的合成）：取提取的 R

25、NA 11 L，加入 2 L、10 mo1/L 的反轉錄引物（見附錄 C），4 L 5×反轉錄緩沖液、0.5 L 反轉錄酶、0.5 L RNA 酶抑制劑、2 L dNTP Mixture 至20 L，42 孵育 1 h，即得到 cDNA 溶液，直接用于 PCR 擴增或20 凍存備用。8.3.2.2 PCR 擴增體系：在反應管中依次加入 8 L 無核酸酶水、10 L 2×Taq Master Mix、1 L 上述cDNA 溶液、0.5 L 上游引物和 0.5 L 下游引物（見附錄 C，引物濃度均為 10 mol/L），混勻，瞬時離心，使液體全部集中于管底。5DB53/T 10

26、64.120218.3.2.3PCR 擴增條件：94 預變性 3min，94 變性 10s，56 退火 30s，72 延伸 25s，循環 30次，72 延伸 5min。擴增反應結束后立即取擴增產物進行電泳檢查或置于 4 冰箱備用。8.3.3 擴增產物的電泳檢測制備1.5 %瓊脂糖凝膠板。在電泳槽內加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取3 L5 L 擴增產物加到凝膠孔，加入5 L DNA分子量標準。恒壓（8 V10 V/cm凝膠長度）電泳30min40min， 隨后取出凝膠，置于凝膠成像系統下觀察擴增結果。8.4 新城疫病毒 F 基因的 RT-PCR 擴增及測序分析8.4.1

27、 病毒 RNA 的提取按照 8.3.1 步驟進行。8.4.2 引物針對新城疫病毒F基因設計的引物見附錄C。8.4.3 RT-PCR 擴增（一步法）8.4.3.1 RT-PCR 擴增體系配制見表 1。體系配好后，蓋緊 PCR 反應管蓋，并做好標記。8.4.3.2 使用瞬時離心使液體都沉降到PCR 管底。同時設立陽性對照和陰性對照。PCR 擴增程序：42 反轉錄 30min；95 預變性 3min；94 變性 30s，55 退火 30s；72 延伸 45s 共進行 35 次循環；72 再延伸 7min。PCR 產物置于 4 保存或20 凍存備檢。表 1RT-PCR 擴增體系組分體積（L）無 RNA

28、 酶滅菌超凈水14.610×擴增反應緩沖液2.5dNTPs（2.5 mmol/L each）2.0RNase 抑制劑（40 U/L）0.5AMV 反轉錄酶（5 U/L）0.7Taq 酶（5 U/L）0.7F 基因上游引物（10 mol/L）0.5F 基因下游引物（10 mol/L）0.5模板 RNA3.0總計258.4.4 擴增產物電泳檢查參照8.3.3操作。8.4.5 測序分析將PCR產物用膠回收試劑盒回收、純化，做核酸測序，所獲序列用DNAstar（5.0）分析并在NCBI 網站上做BLAST在線比對。根據核苷酸序列推導分離毒株F的氨基酸序列，確定內切蛋白酶識別位點的堿性氨基酸數

29、量。6DB53/T 1064.120219 試驗數據處理9.1 HA 試驗結果判定9.1.1 將血凝反應板傾斜呈約 60°，觀察 RBCs 有無呈淚珠樣流淌，出現淚珠樣流淌的反應孔判定為病毒血凝陰性。9.1.2 完全凝集（無淚珠樣流淌）的病毒最大稀釋倍數為該病毒樣品（尿囊液）的血凝滴度，其相應 的病毒含量表示為 1 個血凝單位（HAU)，再根據開始的稀釋倍數精確計算血凝滴度。9.1.3 血凝判定標準：紅細胞均勻分散在孔內、傾斜血凝板時不流淌判為完全凝集，記作+；75% 凝集記作+；50%凝集記作+；25%凝集記作+；紅細胞匯集于孔底中央呈圓點、傾斜血凝板時與對照 孔（僅含 25 L

30、RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集，記作。9.2 HI 試驗結果判定9.2.1 紅細胞均勻分散在孔底周圍、傾斜血凝板時不流淌判為完全凝集，記作+；75%凝集記作+； 50%凝集記作+；25%凝集記作+；紅細胞集中在孔底中央呈圓點、傾斜血凝板時與對照孔（僅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集或血凝被抑制，記作。9.2.2 完全抑制 4 HAU 病毒抗原的最高血清稀釋倍數為該血清的 HI 滴度。9.2.3 檢查各種對照：陰性對照血清 HI 滴度不高于 4（記作 22 或 2 log2），陽性對照血清 HI 滴度應在已知滴度

31、的一個稀釋度以內，紅細胞對照應無自凝現象，結果有效，試驗成立。9.2.4 如果高于 1:16（24 或 4 log2）稀釋度的血清能抑制 4 HAU 的病毒抗原，HI 滴度被判為 HI 抗體陽性，表明動物發生新城疫病毒感染或接種過新城疫疫苗。9.2.5 如果血清 HI 滴度為 16，判為可疑，需重復 HI 試驗，若 HI 滴度仍為 16，可判定血清抗體陽性， 若 HI 滴度為 8 則判定為血清抗體陰性。9.2.6 在所有的確診試驗中針對試驗采用的 HAU 應設病毒 HA 滴度的追溯性測定。9.2.7 當血凝活性不被禽流感病毒抗體和禽腺病毒抗體阻斷，便可初步判定為禽副黏病毒陽性。9.3 L 和

32、M 基因擴增結果判定使用L基因引物做PCR擴增呈陽性結果時，禽副黏病毒各血清型的擴增產物均約121 bp。進而使用M基因引物擴增NDV陽性對照、陰性對照和待測分離毒株，其擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，陰、陽性對照同時成立表明試驗有效，否則試驗無效。在陰、陽性對照結果成立的前提下，如果待檢樣品的RT-PCR產物凝膠電泳后在約300 bp位置出現特異性的單一條帶，則初步判定為禽副黏病毒1型即NDV 核酸陽性。9.4 F 基因擴增結果及毒力判定9.4.1 試驗成立條件：凝膠電泳陽性對照出現約 535 bp 擴增條帶，同時陰性對照無擴增條帶。9.4.2 待檢樣品出現 535 bp 左右的目的片段（與陽

33、性對照大小相符），判為新城疫病毒核酸陽性；待檢樣品未出現目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。9.4.3 若 NDV 分離毒株 F2 亞基的羧基端有 3 個以上堿性氨基酸（精氨酸或賴氨酸）殘基而 F1 亞基的氨基端即 117 位為苯丙氨酸，判定該分離毒株為 NDV 強毒株。7DB53/T 1064.12021附錄A（規范性） 試劑配制A.1 1.5%瓊脂糖凝膠稱取瓊脂糖1.5 g，放入100 mL 1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60 時，加入5 L核酸染料，迅速混勻并鋪板，使凝膠厚度為3 mm5 mm。A.2 50×TAE電泳緩沖液A.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）：稱取EDTA 18.61 g，加滅菌雙蒸水至100 mL，后用氫氧化鈉調pH至8.0。A.2.2 50×TAE電泳緩沖液：Tris堿242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加滅菌雙蒸水溶解至1 000 mL。A.3 溴化乙啶（EB）溶液溴化乙啶20 mg，加滅菌