1、第十三章第十三章 可見和紫外分光光度法可見和紫外分光光度法Visible and Ultraviolet SpectrophotometryVisible and Ultraviolet Spectrophotometry Light spectrum350nm800 nm500 mm1 cm1000.1X-rayg-rayUV &Vis IRMWRadio分光光度法：根據物質的吸收光譜及光的吸收定分光光度法：根據物質的吸收光譜及光的吸收定律，對物質進行定量定性分析的一種分析方法律，對物質進行定量定性分析的一種分析方法靈敏度高，檢出限靈敏度高，檢出限 10-510-6 mol L-1(

2、 微量及痕微量及痕量組分量組分)準確度較高準確度較高:相對誤差：相對誤差：2% 5% ， 若使用精密儀器相對誤差可降至若使用精密儀器相對誤差可降至1-2。波譜名稱波譜名稱 波長范圍波長范圍 分分 析析 方方 法法 射線射線 0.005 0.17nm 中子活化分析，穆斯堡爾譜法中子活化分析，穆斯堡爾譜法 X射線射線 0.1 10nm X射線光譜法射線光譜法 遠紫外遠紫外 10 200nm 真空紫外光譜法真空紫外光譜法 近紫外近紫外 200 400nm 紫外光譜法紫外光譜法 可見光可見光 400 760nm 比色法比色法，可見吸光光度法可見吸光光度法 近紅外近紅外 0.76 2.5 m紅外光譜法紅

3、外光譜法 中紅外中紅外 2.5 50 m紅外光譜法紅外光譜法遠紅外遠紅外 50 1000 m紅外光譜法紅外光譜法 微微 波波 1 1000 mm 微波光譜法微波光譜法 射射 頻頻 1 1000 m 核磁共振光譜法核磁共振光譜法 13.1物質的吸收光譜物質對光的選擇性吸收物質對光的選擇性吸收 M(基態基態) + h M*(激發態激發態) M(基態基態) + h M*(激發態激發態)互補色光示意圖互補色光示意圖光的互補：黃光的互補：黃籃籃物質的物質的顏色顏色 吸吸 收收 光光 物質的物質的顏色顏色 吸吸 收收 光光 顏色顏色 /nm顏色顏色 /nm黃綠黃綠 紫紫 400 450紫紫 黃綠黃綠 56

4、0 580 黃黃 藍藍 450 480 藍藍 黃黃 580 600 橙橙 綠藍綠藍 480 490 綠藍綠藍 橙橙 600 650 紅紅 藍綠藍綠 490 500 藍綠藍綠 紅紅 650 760 紫紅紫紅 綠綠 500 560 物質的顏色與吸收光顏色的互補的關系物質的顏色與吸收光顏色的互補的關系三鄰二氮菲合鐵（三鄰二氮菲合鐵（）離子）離子的吸收光譜的吸收光譜 將不同波長的光通過一定濃度的溶液，分別測定將不同波長的光通過一定濃度的溶液，分別測定溶液對各種波長的光的吸光度。以入射光的波長溶液對各種波長的光的吸光度。以入射光的波長 為橫坐標，相應的吸光度為橫坐標，相應的吸光度 A A 為縱坐標作圖，

5、可得到為縱坐標作圖，可得到一條吸光度隨波長變化的曲線，稱為吸收曲線或吸收一條吸光度隨波長變化的曲線，稱為吸收曲線或吸收光譜。光譜。吸收籃綠色的光，顯示橙紅色吸收籃綠色的光，顯示橙紅色最大吸收波長最大吸收波長max吸收曲線吸收曲線吸收曲線討論吸收曲線討論同一物質對不同波長光的吸光度不同，吸光度同一物質對不同波長光的吸光度不同，吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長最大處對應的波長稱為最大吸收波長max；不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似似,max不變；而對于不同的物質，它們的吸不變；而對于不同的物質，它們的吸收曲線形狀和收曲線形狀和max不相同；不相同

6、；從吸收曲線形狀可以解釋物質的顏色，物質的從吸收曲線形狀可以解釋物質的顏色，物質的顏色與吸收光顏色互為補色。顏色與吸收光顏色互為補色。13.2分光光度法基本原理分光光度法基本原理I0Itbt0lglgII=T-=A0II=Tt透光率和吸光度透光率和吸光度透光率透光率 吸光度吸光度透光率和吸光度的關系透光率和吸光度的關系t0lgII=ALambert-Beer law1760 年，年， Lambert 指出：一束平行單色光通過指出：一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液液層的厚度成正有色溶液后，光的吸收程度與溶液液層的厚度成正比。比。 A = k1 d1982年，年，Beer 指出：一

7、束平行單色光通過有色溶指出：一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液的濃度成正比。液后，光的吸收程度與溶液的濃度成正比。 A = k2 cB將將 Lambert 定律和定律和 Beer 定律合并起來，就得到定律合并起來，就得到 Lambert-Beer 定律。定律。 Lambert-Beer 定律定律A = b c b：液層厚度：液層厚度 （cm）；）；c：物質的量濃度：物質的量濃度molL-1); :摩爾吸光系數摩爾吸光系數Lmol-1cm-1）。）。LambertBeer定律是吸光光度法的理論基礎和定律是吸光光度法的理論基礎和定量分析的依據，廣泛應用于紫外光、可見光、定量分析的依據

8、，廣泛應用于紫外光、可見光、紅外光區的吸收測量，也適用于原子吸收測量。紅外光區的吸收測量，也適用于原子吸收測量。 摩爾吸光系數摩爾吸光系數Lmol-1cm-1） 吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數，不隨濃吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數，不隨濃度度c和光程長度和光程長度b的改變而改變，在溫度和波長等條件一的改變而改變，在溫度和波長等條件一定時，定時， 僅與吸收物質本身的性質有關；僅與吸收物質本身的性質有關； 同一吸收物質在不同波長下的同一吸收物質在不同波長下的max不同；不同； max表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了吸光光度法

9、測定該物質可能達到的最大靈敏度，了吸光光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度，max越大，表明該物質的吸光能力越強，用光度法測越大，表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高，定該物質的靈敏度越高，1000即可進行分光光度法測即可進行分光光度法測定。定。A = b c 例例13-1 13-1 用鄰菲羅啉法測定鐵，知用鄰菲羅啉法測定鐵，知 Fe2+ Fe2+ 的質量的質量濃度為濃度為 1.0 1.010-3 gL-110-3 gL-1。用。用2cm2cm吸收池，在波長吸收池，在波長508508nm nm 處測得吸光度處測得吸光度A A 為為0.380.38，計算鐵，計算鐵()-()-

10、鄰菲羅鄰菲羅啉配離子的摩爾吸收系數。啉配離子的摩爾吸收系數。解：解：Fe2+Fe2+濃度為：濃度為：2+312+512+1(Fe )1.0 10 g L(Fe )1.8 10 mol L(Fe )55.85g molcMr-1mol Fe2+能生成1mol Fe ()- 鄰菲羅啉配離子，因此配離子濃度也為 。511.8 10 mol L-52151B0.381.1 10 dmmol1.8 10 mol L0.2dmAc d-bc13.3 可見分光光度法可見分光光度法一、分光光度計一、分光光度計光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器顯示器顯示器顯示顯示A/T窗口窗口選擇波長選擇波長樣品室樣

11、品室吸收池吸收池（比色皿）（比色皿）單一波長，沒有掃描功能。單一波長，沒有掃描功能。TU-1810暗室蓋暗室蓋TU-1810紫外可見分光光度計紫外可見分光光度計樣品池（一光源（一光源 對光源的基本要求是應在儀器操作所需的光譜區域內對光源的基本要求是應在儀器操作所需的光譜區域內能夠發射連續輻射，有足夠的輻射強度和良好的穩定性，能夠發射連續輻射，有足夠的輻射強度和良好的穩定性，而且輻射能量隨波長的變化應盡可能小。而且輻射能量隨波長的變化應盡可能小。 分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。源兩類。 熱輻射光源用于可見光區，如鎢絲燈和鹵鎢燈

12、；鎢燈熱輻射光源用于可見光區，如鎢絲燈和鹵鎢燈；鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在和碘鎢燈可使用的范圍在340 2500nm。 氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。它們可氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。它們可在在160 375 nm范圍內產生連續光源。氘燈的燈管內充有范圍內產生連續光源。氘燈的燈管內充有氫的同位素氘，它是紫外光區應用最廣泛的一種光源，其氫的同位素氘，它是紫外光區應用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強度比相同功率的氫燈要大光譜分布與氫燈類似，但光強度比相同功率的氫燈要大35倍。倍。 back（二單色器（二單色器 單色器是能從光源輻射的復合光中分出單色單色器是能從光

13、源輻射的復合光中分出單色光的光學裝置，其主要功能：產生光譜純度高的光的光學裝置，其主要功能：產生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區域內任意可調。波長且波長在紫外可見區域內任意可調。 單色器一般由入射狹縫、準光器透鏡或凹單色器一般由入射狹縫、準光器透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度度、入射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度度、選擇性

14、及校準曲線的線性關系等。選擇性及校準曲線的線性關系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。 棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350 3200 nm的波長范圍，即只能用于可見光域內。石英的波長范圍，即只能用于可見光域內。石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185 40

15、00nm，即可用，即可用于紫外、可見和近紅外三于紫外、可見和近紅外三 個光域。個光域。 光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個波長區具有良好的、幾外、可見及紅外光域，而且在整個波長區具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領高、成本低、便于保存和易于制備等優點。缺點是各級領高、成本低、便于保存和易于制備等優點。缺點是各級光譜會重疊而產生干擾。光譜會重疊而產生干擾。 Back（三吸收池（三吸收池 吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻吸收池

16、用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區及紫外光區，璃材料兩種。石英池適用于可見光區及紫外光區，玻璃池只能用于可見光區。為減少光的損失，吸玻璃池只能用于可見光區。為減少光的損失，吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向。在高精收池的光學面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測定中紫外區尤其重要），吸收池要度的分析測定中紫外區尤其重要），吸收池要挑選配對。因為吸收池材料的本身吸光特征以及挑選配對。因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結果都有影響。吸收池的光程長度的精度等對分析結果都有影響。 back（四檢測器（四檢測器 檢測器的功能是檢測信號、測量

17、單色光透過溶液后光檢測器的功能是檢測信號、測量單色光透過溶液后光強度變化的一種裝置。強度變化的一種裝置。 常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。 硒光電池對光的敏感范圍為硒光電池對光的敏感范圍為300800nm，其中又以，其中又以500 600nm最為靈敏。這種光電池的特點是能產生可直接推最為靈敏。這種光電池的特點是能產生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現疲勞效應而動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現疲勞效應而只能用于低檔的分光光度計中。只能用于低檔的分光光度計中。 光電管在紫外光電管在紫外-可見分光光度計上應用較為廣泛。可見

18、分光光度計上應用較為廣泛。 光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細結構有較好的分辨能力。狹縫，從而對光譜的精細結構有較好的分辨能力。back（五信號指示系統（五信號指示系統 它的作用是放大信號并以適當方式指示或記錄下來。它的作用是放大信號并以適當方式指示或記錄下來。常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調節指零裝置以常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調節指零裝置以及數字顯示或自動記錄裝置等。很多型號的分光光度計裝及數字

19、顯示或自動記錄裝置等。很多型號的分光光度計裝配有微處理機，一方面可對分光光度計進行操作控制，另配有微處理機，一方面可對分光光度計進行操作控制，另一方面可進行數據處理。一方面可進行數據處理。吸光度與透光度標尺吸光度與透光度標尺back 二、測定方法及應用二、測定方法及應用 (一一) 標準曲線法標準曲線法 1、配制一系列已知濃度的標準溶液；、配制一系列已知濃度的標準溶液； 2、用同樣厚度的吸收池測定其吸光、用同樣厚度的吸收池測定其吸光度；度； 3、以吸光度為縱坐標，標準溶液濃、以吸光度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標度為橫坐標 作圖，得標準曲線作圖，得標準曲線(standard curve) 或稱為

20、工或稱為工 作曲線作曲線(working curve) 。MMC絲裂霉素水溶液的標準曲線絲裂霉素水溶液的標準曲線051015200.00.20.40.60.81.01.2r rx UV-3150 max=364nmAbsorbanceConcertration of MMC ( g/mL ) x2503003504004500.00.20.40.60.81.01.21.4 20 10 6.68 5 4 2 0.4Concertration of MMC: g/mL Wavelength (nm)Absorbance max=364nm (二二) 標準對照法標準對照法 1、配制一個與被測溶液濃度

21、相近的標準、配制一個與被測溶液濃度相近的標準溶溶 液液(其濃度用其濃度用cs表示表示)； 2、在、在max處測出標準溶液吸光度處測出標準溶液吸光度As； 3、在相同條件下測出試樣溶液的吸光度、在相同條件下測出試樣溶液的吸光度Ax； 4、試樣溶液濃度、試樣溶液濃度cx可按下式求得：可按下式求得： sscAxAxc (三三)比吸光系數比較法比吸光系數比較法 比吸光系數比較法是利用標準的值進比吸光系數比較法是利用標準的值進行定量測定的，即將樣品的比吸光系數與行定量測定的，即將樣品的比吸光系數與標準物質的比吸光系數比較，計算出樣品標準物質的比吸光系數比較，計算出樣品含量含量(質量分數或體積分數質量分數

22、或體積分數)。 醫藥學實際中有時也用比吸光系數。比吸醫藥學實際中有時也用比吸光系數。比吸光系數是指光系數是指100mL 溶液中含被測物質溶液中含被測物質 1g ，液，液層厚度層厚度 b 為為1cm時的吸光度值，用時的吸光度值，用 表示。表示。 1%1cmE 例如：廣譜抗菌藥呋喃妥因的例如：廣譜抗菌藥呋喃妥因的 (367nm) = 746，在相同條件下，在相同條件下，測定呋喃妥因樣品的測定呋喃妥因樣品的(367nm) = 738，因此，該樣品中呋喃妥因的，因此，該樣品中呋喃妥因的質量分數為：質量分數為： 30.9897467381%1cmE1%1cmE (四四)差示分光光度法差示分光光度法 適用

23、范圍：濃度過高或過低的溶液。適用范圍：濃度過高或過低的溶液。 優點：減少相對誤差。優點：減少相對誤差。 原理：用與待測樣品濃度相近的標原理：用與待測樣品濃度相近的標準溶液準溶液c1作參比溶液，測定同種未知濃作參比溶液，測定同種未知濃度度c2樣品的吸光度。樣品的吸光度。 如：用空白溶液做參比時如：用空白溶液做參比時T空白溶空白溶液液=100%）：）： T試樣試樣= I試樣試樣/I空白溶液空白溶液=5/100= 5%， T標準溶液標準溶液=I標準溶液標準溶液/I空白溶液空白溶液=10/100=10%；用該標準溶液做參比時（用該標準溶液做參比時（ T標準溶液標準溶液=100%）：）：T試樣試樣=I試

24、樣試樣/I標準溶液標準溶液=5/10=50%.13.4分光光度法的誤差和測量條件的選擇分光光度法的誤差和測量條件的選擇分光光度法的誤差分光光度法的誤差偏離偏離Beer定律的誤差定律的誤差儀器測量誤差儀器測量誤差光電管的靈敏性差、光電流測量不準、光電管的靈敏性差、光電流測量不準、光源不穩定、讀數不準光源不穩定、讀數不準主觀誤差主觀誤差操作不當引起，如步驟不規范，顯色劑操作不當引起，如步驟不規范，顯色劑用量、放置時間、反應溫度等。用量、放置時間、反應溫度等。 偏離偏離beer定律的原因定律的原因物理因素物理因素非單色光引起的偏離非單色光引起的偏離非平行入射光引起的偏離非平行入射光引起的偏離介質不均

25、勻引起的偏離介質不均勻引起的偏離化學因素化學因素溶液濃度過高引起的偏離溶液濃度過高引起的偏離化學反應引起的偏離化學反應引起的偏離 溶劑對紫外溶劑對紫外-可見光譜的影響較為復雜。改可見光譜的影響較為復雜。改變溶劑的極性，會引起吸收帶形狀的變化。例變溶劑的極性，會引起吸收帶形狀的變化。例如，當溶劑的極性由非極性改變到極性時，精如，當溶劑的極性由非極性改變到極性時，精細結構消失，吸收帶變向平滑。細結構消失，吸收帶變向平滑。 改變溶劑的極性，還會使吸收帶的最大吸收改變溶劑的極性，還會使吸收帶的最大吸收波長發生變化。下表為溶劑對亞異丙酮紫外吸波長發生變化。下表為溶劑對亞異丙酮紫外吸收光譜的影響。收光譜的

26、影響。 正己烷正己烷 CHCl3 CH3OH H2O * max/nm 230 238 237 243 n *max/nm 329 315 309 305溶劑對紫外、可見吸收光譜的影響溶劑對紫外、可見吸收光譜的影響 1. 波長：波長： (max) 最大最大 2. 顯色劑及用量顯色劑及用量 3. 溶液酸度溶液酸度 4.顯色時間與穩定時間顯色時間與穩定時間 5. 干擾物的掩蔽干擾物的掩蔽 6. 合適的濃度范圍合適的濃度范圍 線性范圍及吸光度線性范圍及吸光度 7.選擇適當的參比溶液選擇適當的參比溶液 測量條件的選擇測量條件的選擇M + R = MR (被測物被測物) (顯色劑顯色劑) (有色產物有色

27、產物) ，靈敏度，靈敏度。 10000靈敏度高靈敏度高選擇性好選擇性好生成的有色物質應有確定的組成生成的有色物質應有確定的組成生成的有色物質應穩定生成的有色物質應穩定顯色劑在測定波長處無明顯吸收顯色劑在測定波長處無明顯吸收選擇適當的顯色劑選擇適當的顯色劑控制顯色反應的酸度，使顯色劑僅與被測控制顯色反應的酸度，使顯色劑僅與被測物質起反應物質起反應加入掩蔽劑，使其與干擾離子生成更穩定加入掩蔽劑，使其與干擾離子生成更穩定的無色配合物，而與被測定物質和顯色劑不的無色配合物，而與被測定物質和顯色劑不發生反應發生反應在測定前預先通過離子交換、沉淀分離或在測定前預先通過離子交換、沉淀分離或溶劑萃取法等分離干擾離子溶劑萃取法等分離干擾離子共存離子的干擾及消除共存離子的干擾及消除T = 36.8% (A=0.434) 時，時， C / C最小。最小。控制范圍：控制范圍：T：20%65%，A：0.70.2 測量誤差和透光率的關系測量