1、 染色體步移法克隆知序列的側翼序列染色體步移法克隆知序列的側翼序列 轉座子隨機突變及目的表型的挑選轉座子隨機突變及目的表型的挑選 大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖苷酶的誘導半乳糖苷酶的誘導 利用利用SDS-PAGE分析交融蛋白的可溶性分析交融蛋白的可溶性 綠色糖單胞菌的發酵及孢外酶的提取綠色糖單胞菌的發酵及孢外酶的提取轉座子隨機突變及目的表型的挑選李麗萍實驗目的實驗目的1.了解細菌常見轉座子Tn5的構造及轉座機理2. 學習利用轉座子進展隨機插入突變的實驗過程3. 掌握雙親接合實驗的原理及過程實驗原理轉座子：轉座因子或騰躍因子，它可以從遺傳物質的一部分騰躍到另一部分，從而引起遺傳變異。轉座子的發現：20

2、世紀50年代初期，美國冷泉港實驗室遺傳育種學家McClintock 經過對玉米籽粒色斑不穩定景象的研討而發現轉座景象，初次發現了能在基因組內不同區域轉移的控制成分。實驗原理細菌轉座子的類型：插入序列 (Insertion sequence);復合轉座子 (Composite transposons); Tn5TnA 轉座子家族 (TnA family);可挪動噬菌體 (Mu phage).實驗原理Tn5：發現于E.coli，序列全長5818bp。中心序列：編碼三個抗生素(新霉素、博萊霉素、鏈霉素)； 兩個倒置的IS50：IS50R編碼53KD的Tnp和48KD的轉座阻遏蛋白(Inh),兩者運用

3、同一閱讀框，但啟動子不同。IS50L的第1442堿基處存在一個赭石突變，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7個堿基不一樣，是轉座酶(Tnp)的作用位點。kanr strr bleorOE IE IE OEIS50L IS50RP1 (Tnp)P2 (Inh)P3P4突變位點(Mutation site)Tn5的轉座機理實驗原理實驗原理DNA sequencing實驗原理非轉移性質粒：轉移性質粒：能自動地從一個細胞轉移到另一個細胞，甚至還能 帶動供體細胞的染色體DNA向受體細胞轉移;接協作用：質粒在細菌間的轉移，需求供體和受體細胞間的直接 接觸才干進展.受體菌，Ap Nx巴西固氮螺菌Sp7供

4、體菌 S17-1質粒pRL1063a,Km重組巴西固氮螺菌，Ap Nx Km實驗原理植物生長激素，由植物根系細菌合成，對植物的生長及一些發育階段的調控起關鍵作用細菌中IAA合成的幾種途徑A-B：吲哚乙酰胺途徑；E-F-D：吲哚丙酮酸途徑；C-D：色氨酸側鏈途徑實驗資料 菌株 E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp7 2. 培育基及試劑 (1). 細菌豐富培育基LB培育基 LD培育基胰蛋白胨 (g) 10 10酵母提取物 (g) 5 5氯化鈉 (g) 10 2.5pH 7.0 6.8固體培育基參與1.3% 瓊脂粉，dH2O定容至1L，121滅菌20min(2).用于I

5、AA搖瓶培育的培育基(MAZ培育基)(3).抗生素抗生素稱號 儲存液配制方法氨芐青霉素 (Ap) 100 mg/ml 水溶液，-20 25 g/ml卡那霉素(Km) 100 mg/ml 水溶液，-20 50 g/ml 30-50 g/ml萘啶酮酸(Nx) 20 mg/ml 水溶液，-20 5 g/mlE.coli A.brasilense運用濃度3. 主要儀器 小型離心機實驗步驟第一天：第一天：中午中午12：3013：30接種接種sp7 至至5ml LD 液體培育基中，液體培育基中，30振蕩培育約振蕩培育約20小時。小時。晚晚5：30，接種供體菌，接種供體菌pRL1063a/E.coil S1

6、7-1 至至5ml LB+Km液體培育基中，液體培育基中，37振蕩培育約振蕩培育約16小時。小時。第二天：第二天：上午上午9：00，用同一個，用同一個1.5 ml 離心管搜集適量供體菌和受體菌。離心管搜集適量供體菌和受體菌。12000rpm 離心離心30 sec，棄上清，用移液器將菌泥懸浮混勻后，棄上清，用移液器將菌泥懸浮混勻后移入移入LD平板中央，盡量減少氣泡的產生。平板中央，盡量減少氣泡的產生。 30正置培育過夜。正置培育過夜。 留意：事先預備好留意：事先預備好LD平板平板 第三天：用液體LD培育基洗下菌泥，鋪于同時含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30培育，挑選接合子。第四天：挑取接合子在含有上述三種抗生素的LD培育基平板上劃線分別，保證得到的為單菌落。第五天：挑單菌落分別接種于5ml MAZ培育基中30搖瓶培育野生菌對照.第六天：用比色法測定菌液中的IAA含量。比色試劑：含12g/L FeCl3 的H2SO4 留意平安取1ml 丈量OD600；取1ml 菌液12000rpm 離心 5min后取上清與比色試劑等量混合，搖勻后在暗處放置30 min，然后測OD540nm注：空白對照，未接菌的培育基與比色用試劑的混合液。規范曲線實驗結果菌株(Strains)