1、安 徽 農 業 大 學畢 業 論 文（設計）論文題目 真菌發酵液對納塔爾鏈霉菌納他霉素產量的影響 姓 名 學 號 院 系 _生命科學學院_ 專 業 生物技術_指導教師 職 稱 講師_ _中國·合肥二o 1 3 年 5 月目錄摘要 1前言 11實驗材料及方法 21.1實驗材料 2 1.1.1實驗菌種 2 1.1.2培養基 21.2實驗方法 2 1.2.1納塔爾鏈霉菌的培養 2 1.2.2真菌發酵液的制備 2 1.2.3納他霉素產量的測定 2 1.2.4真菌發酵液添加時間對納他霉素產量的影響 2 1.2.5真菌發酵時間對納他霉素產量的影響 2 1.2.6真菌發酵液添加量對納他霉素產量的影

2、響 32結果與分析 32.1納他霉素標準曲線的制作 32.2發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響 3 2.2.1產黃青霉發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響 3 2.2.2黑曲霉發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響 4 2.2.3釀酒酵母發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響 52.3真菌培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響 5 2.3.1 產黃青霉培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響 5 2.3.2黑曲霉培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響 6 2.3.3釀酒酵母培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響 62.4真菌發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響 7 2.4.1產

3、黃青霉發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響 7 2.4.2黑曲霉發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響 8 2.4.3釀酒酵母發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響 83討論與結論 9參考文獻 9致謝 10英文摘要 10真菌發酵液對納塔爾鏈霉菌納他霉素產量的影響 潘 指導教師：曹 （安徽農業大學生命科學學院2021級生物技術1班，學號09121012）摘要：納他霉素是由納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）、褐黃孢鏈霉菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加鏈霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌株發酵而產

4、生的一種廣譜抗真菌劑。因其低毒和極小改變食物本身味道可作為生物防腐劑。本實驗通過在納塔爾鏈霉菌N5菌株中添加真菌發酵液的方法提高菌株納他霉素的產量。實驗結果表明產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母三種菌的發酵液均對納塔爾鏈霉菌N5菌株的納他霉素產量有明顯的促進作用。產黃青霉和黑曲霉培養1d時，其發酵液對N5菌株納他霉素的合成促進效果最佳，而釀酒酵母在3d時促進效果最好，此時菌株納他霉素產量較未加真菌發酵液處理樣品高出約1倍。關鍵詞：納塔爾鏈霉菌N5菌株 納他霉素 產黃青霉 黑曲霉 釀酒酵母 前言1955年struyk等人首次從南非natal州土壤中分離得到納塔爾鏈霉菌（streptomyces nata

5、lensis），并發現該菌種可以產生一種內酯類抗生素，strnyk將其命名為匹馬菌素（pimaricin）1，后世界衛生組織將其統一命名為納他霉素。該抗生素是一種二十六元多烯大環內酯類抗生素，主要由納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）、褐黃孢鏈霉菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加鏈霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌發酵產生2。納他霉素是一種高效、廣譜的抗真菌劑，能有效抑制霉菌及酵母的生長，并能有效抑制絲狀真菌中黃曲霉素的形成，可廣泛應用于食品保鮮及治療真菌引起的疾病3。由于其分子上的疏水部分可以范德華力

6、與細胞質膜上的甾醇分子結合，形成抗生素甾醇復合物，破壞細胞質膜滲透性，引起菌體細胞內電解質滲出，因而可導致菌體死亡，起到抑菌作用4。納他霉素在室溫下溶解度僅為30-100mg/L，微溶于甲醇，易溶于稀酸、冰醋酸和二甲基甲酰胺，不溶于非極性溶劑5。一般認為，由于納他霉素難溶于水和油脂，所以很難被消化和吸收，因此人體攝入的納他霉素大部分會隨糞便排出6。因為納他霉素具有毒性低和不會對食品天然風味有較大改變的性質，美國食品及藥物管理局(FDA)和我國衛生部已經先后于1982年與2021正式批準納他霉素作為食品添加劑。迄今為止納他霉素已經在食品工業中得到廣泛應用7。由于各種因素的制約，國內納他霉素的主要

7、來源至今仍然是從國外進口。限制我國自主生產納他霉素的主要問題是菌株產量偏低，導致納他霉素的生產成本過高。這已成為急需解決的問題。提高納他霉素產量可以通過添加誘導子的方法。已有報道稱一些微生物的發酵代謝物可產生某種誘導子調節其它微生物的次級代謝，促進其次級代謝產物的生成8,9,10。本實驗將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母的發酵液分別添加入納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）發酵液中，研究不同真菌發酵液對該菌株納他霉素產量的影響，以期提高菌株納他霉素產量。1實驗材料與方法1.1實驗材料1.1.1 菌種納塔爾鏈霉菌N5菌株由中國科學院合肥物質科學研究院等離子所提供。黑曲霉、產黃

8、青霉、釀酒酵母由安徽農業大學生命科學學院微生物學實驗室保藏。1.1.2 培養基種子培養基 (g/L)：葡萄糖20、酵母浸膏5、蛋白胨6、氯化鈉10，pH 7.2發酵培養基 (g/L)：葡萄糖10、酵母浸膏5、大豆蛋白胨20、淀粉40，pH7.21.2實驗方法1.2.1 納塔爾鏈霉菌的培養 用接種環刮取斜面菌種一環于裝有25mL種子培養基的250mL三角瓶中，28、 200r/min搖床培養，40h后以9%接種量接種于裝有30mL發酵培養基的250mL三角瓶中，28、200r/min搖床培養 4d。1.2.2 真菌發酵液的制備將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母分別接種于裝有100mL發酵培養基的250

9、mL三角瓶中，28、150r/min搖床培養適當時間，用八層紗布過濾，再在10000r/min下離心15min，取上清液進行微孔濾膜過濾即可得到無菌的真菌發酵液。1.2.3 納他霉素產量的測定稱取納他霉素標準樣品，溶于5%冰乙酸的甲醇溶液中，使納他霉素濃度分別為1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L，用紫外分光光度計測其在303nm處的OD值，以納他霉素濃度為橫坐標，OD303值為縱坐標，繪制標準曲線。取N5菌株發酵液0.8mL于7.2mL 5%冰乙酸的甲醇溶液中。在震蕩器上震蕩5min后10000r/min離心15min。取上清液用紫外

10、分光光度計測量303nm波長下的吸光度，根據標準曲線計算納他霉素產量。1.2.4 真菌發酵液添加時間對納他霉素產量的影響將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母培養3d后分別以5%接種量接種于納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵液中，接種時間分別為0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，每個處理重復3次，并以不添加真菌發酵液的處理為對照。培養4d后測定菌株納他霉素產量。確定真菌發酵液最適添加時間。 1.2.5 真菌發酵時間對納他霉素產量的影響分別在產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母培養1d、2d、3d時取樣，制備無菌發酵液。將培養不同時間的真菌發酵液以5%接種量加入培養12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵培養液中，

11、每個處理重復3次，并以不添加真菌發酵液的處理為對照。繼續培養84h后測定菌株納他霉素產量。確定3種真菌的最佳發酵時間。1.2.6 真菌發酵液添加量對納他霉素產量的影響將產黃青霉、黑曲霉培養1d，釀酒酵母培養3d，制備無菌發酵液，并分別以1% 、2% 、5% 、8% 、10% 、15% 、20%的添加量加入到培養12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵培養液中，每個處理重復3次并以不添加真菌發酵液的處理為對照。培繼續培養84h后測定菌株納他霉素產量。確定3種真菌的最佳發酵時間。2結果及分析2.1 納他霉素標準曲線的制作以納他霉素濃度為橫坐標，OD303值為縱坐標繪制納他霉素標準曲線，見圖1。由圖1可看出

12、納他霉素濃度與OD303值呈線性相關，且R2=0.9988線性較好。因此可通過此標準曲線方程x=（y0.0065)/0.1489計算納他霉素產量。圖1 納他霉素標準溶液曲線Fig1 The standard curve of natamyctn2.2 發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響2.2.1產黃青霉發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響將產黃青霉發酵培養基進行適當處理后接種于培養不同時間的納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵液中，繼續培養，當菌株培養4d時用紫外分光光度法測定納他霉素產量，結果如圖2所示。由圖2可看出產黃青霉發酵液對N5菌株納他霉素產量有明顯的促進作用，當在發酵培養12h時

13、添加效果最佳，此時菌株納他霉素產量達1.42g/L，較對照提高65.96。 圖2 產黃青霉發酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 2 Effects of addition time of fermentation broth of Penicillium chrysogenum on the natamycin production of N5 strain2.2.2黑曲霉發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響將培養3d的黑曲霉發酵培養液適當處理后于不同時間添加入N5菌株發酵培養液中，繼續培養，當菌株培養4d時測定納他霉素產量，結果見圖3。從圖3中可以看出黑曲霉發酵液對N5菌株納他霉素

14、產量的提高有顯著的促進作用。當在發酵培養12h時添加效果最佳，此時菌株納他霉素產量達1.44g/L，較對照提高67.44。圖3黑曲霉發酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 3 Effects of addition time of fermentation broth of Aspergillus Nigeron the natamycin production of N5 strain2.2.3釀酒酵母發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母發酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響見圖4。由圖可見，釀酒酵母發酵液也可明顯促進N5菌株納他霉素的合成，最適接入時間也是菌株培養的12

15、h。 圖4 釀酒酵母發酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 4 Effects of addition time of fermentation broth of Saccharomyces cerevisiae on the natamycin production of N5 strain2.3 真菌培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響2.3.1 產黃青霉培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響將分別培養1d、2d、3d的產黃青霉發酵液進行適當處理，添加至培養12h的N5菌株發酵培養液中，繼續培養84h后測定菌株納他霉素產量，結果如圖5所示。由圖5可以看出培養1d的產黃青霉發酵液對N5菌株納

16、他霉素產量的促進作用最顯著。隨著產黃青霉培養時間的延長，發酵液對N5納他霉素產量的促進作用呈下降趨勢。因此，產黃青霉的最佳培養時間為1d。圖5產黃青霉培養時間對納他霉素產量的影響Fig 5 Effects of culture time of Penicillium chrysogenum on the natamycin production of N5 strain2.3.2黑曲霉培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響 將培養不同時間的黑曲霉發酵液添加入N5菌株發酵液中，培養后測定納他霉素產量，結果見圖6。由圖6可以看出當在N5菌株發酵液中添加培養1d的黑曲霉發酵液時，納他霉素產量最高，因此

17、，黑曲霉的最佳培養時間確定為1d。圖6黑曲霉培養時間對納他霉素產量的影響Fig 6 Effects of culture time of Aspergillus Niger on the natamycin production of N5 strain2.3.3釀酒酵母培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母培養時間對N5菌株納他霉素產量的影響如圖7所示。由圖7可見，當在N5菌株發酵液中添加培養3d的釀酒酵母發酵液時，納他霉素產量最高，因此，釀酒酵母的最佳培養時間確定為3d。圖7釀酒酵母培養時間對納他霉素產量的影響Fig 7 Effects of culture time of Sacc

18、haromyces cerevisiae on the natamycin production of N5 strain2.4真菌發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響2.4.1產黃青霉發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響將培養1d的產黃青霉發酵液處理后以不同添加量添加于培養12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵培養液中，于28、200r/min條件下繼續培養84h，測定納他霉素產量。以產黃青霉發酵液添加量為橫坐標，納他霉素產量為縱坐標做圖，見圖8。從圖8中可以添加5的產黃青霉發酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最顯著，此時納他霉素產量達1.69g/L，較對照提高94.25%。圖8產黃青霉發酵

19、液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 8 Effects of addition amount of Penicillium chrysogenum fermentation broth on the natamycin production of N5 strain2.4.2黑曲霉發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響將培養1d的黑曲霉發酵液處理后以不同添加量添加于培養12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵培養液中，于28、200r/min條件下繼續培養84h，測定納他霉素產量結果如圖8所示。由圖可看出5的黑曲霉發酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最佳，因此，黑曲霉發酵液的最適添加量確定為5。

20、 圖9黑曲霉發酵液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 9 Effects of addition amount of Aspergillus Niger fermentation broth onthe natamycin production of N5 strain2.4.3釀酒酵母發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母發酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響見圖10。從圖10中可以看出5的釀酒酵母發酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最佳，因此，黑曲霉發酵液的最適添加量確定為5。圖10釀酒酵母發酵液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 10 Effects of additi

21、on amount of Saccharomyces cerevisiae fermentation broth onthe natamycin production of N5 strain3討論與結論 隨著人們對健康、安全問題的日益關注，食品安全問題越來越受到人們的重視，化學防腐劑的缺點逐漸暴露，納他霉素受到人們的青睞。納他霉素是和乳酸鏈球菌素并列的僅有的兩種生物防腐劑，其具有毒性低且不會造成食品風味巨大改變的特性，是一種極具有使用、生產價值的抗生素。但納他霉素產生菌株產量不高一直是我國納他霉素自主生產的瓶頸，過低的單株產量會使生產成本過高而不利于工廠生產。本實驗將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵

22、母發酵液添加入納塔爾鏈霉菌N5菌株發酵液中，研究這3種真菌培養時間、發酵液添加時間及添加量對N5菌株納他霉素產量的影響，以促進菌株納他霉素的合成。實驗結果表明這三種真菌的發酵液均對納塔爾鏈霉菌N5菌株的納他霉素產量有明顯促進作用。產黃青霉和黑曲霉培養1d時，其發酵液對N5菌株納他霉素的合成促進效果最佳，而釀酒酵母在3d時促進效果最好。三種真菌最佳發酵液添加時間及添加量均為12h和5。具體這些真菌發酵液中何種因素對N5菌株納他霉素生產起到促進作用還不清楚，有待于進一步實驗研究。參考文獻1 Marta V Mendes ，sedef Tunca ，Nuria Anton et al The two

23、-component phoR-phoP system of streptomyces natalensis ;inactivation or deletion of phoP reduces the negative phosphate regulation of pimaricin biosynthesis metabolic engineering 2021 ,9 (2)：217227；2 PEDERSEN J C Natamycin as a fungicide imager media JApplied and environment 。microbiobogy 1992 ，58（3

24、）.10641066；3 陳曉麗、呂振岳、黃東東等。新型天然食品防腐劑納他霉素的研究進展J食品研究與開發.2021 .23（4）：23；4 盧國營、張朝輝、洪偉杰，新型防腐劑納他霉素的研究進展J中國食品添加劑 2021 （3）：3032；5 魏寶東、孟寬軍、天然生物性食品防腐劑納他霉素的特性及應用J，遼寧農業科學 2021 （2）：2426；6 賀家亮、張敏、趙勝娟，納他霉素的研究現狀J中國食品添加劑2021 （3）：3032；7 Martin J F DEMAIN AL control of antibiotic biosynthesis 1980（02）；8 葉輝、王兆慧、陳佩林等 微生物

25、誘導子對卡諾氏菌屬N05205 菌株的影響J，生物技術，2021 14（6）：5758；9 邊猛、田黎、張久明等，誘導子對海洋真菌penicillium crustosum 204215菌株生物堿代謝的調節作用J海洋學報，2021.30（2）：117123；10 邊猛 海洋真菌產生生物堿代謝調節的研究D：碩士學位論文青島科技大學 生物化工系 。11 史強 真菌代謝產物中促進納他霉素合成的誘導子的研究D：碩士學位論文江南大學。致謝感謝曹老師對于本試驗的悉心指導，她對生物學科領域中的基本問題和發展前景的敏銳洞察力，對學術思想的重視，對選題和研究內容的嚴格要求，以及對論文工作中遇到的關鍵問題和疑難問

26、題的指導使我受益匪淺。她對試驗的研究態度和嚴謹的工作作風給予我今后的學習和工作很深的啟示。同時我還要感謝一起做實驗的同學，他們在我的實驗過程中給了我很大的幫助。The effect of fungus fermented liquid on the output of Streptomyces natalensis natamycinAuthor: instructor: (2021 College of life science of Anhui agricultural University-level biotechnology class 1, 09121012,)Abstract:

27、Natamycin is a broad-spectrum antifungal agent generated by the fermentation of the streptomyces natalensis,streptomyces gilvosporeus,streptomyces chattanoogensis and other strains.It can be used as biological preservatives because it has low toxicity and change food taste lightly.This experiment ad

28、opts the methods of adding Fungal fermentation broth to streptomyces natalensis N5 strains to improve natamycin production of the strains.The results reveal that Fermentation broth of Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae can all improve Production of natamycin well.It

29、 has the best effect on the improvement of the synthesis of natamycin when Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger are cultured for one day.However,Saccharomyces cerevisiae has the best effect of improvement when culture for three days,and when the production of natamycin is one time higher than samples without treatment of fungal fermentation broth.Key words: natamycin product