1、文獻(xiàn)綜述抗生素發(fā)酵研究進(jìn)展專業(yè)年級13生物工程學(xué)院環(huán)資學(xué)院學(xué)生姓名干先府學(xué)號2013125142指導(dǎo)教師常海軍日期2016.4.30抗生素發(fā)酵研究進(jìn)展王先府(重慶工商大學(xué)環(huán)資學(xué)院2013級生物班2013125142)摘要：抗生素是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)，由于其在自然條件下不易獲得，現(xiàn)可利用發(fā)酵來生產(chǎn)抗生素，本文對抗生素發(fā)酵研究過程多方面進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞：抗生素；菌渣；過程優(yōu)化AdvancesinantibioticfermentationJeff(Collegeofenv

2、ironmentandresources,IndustrialandCommercialUniversityOfChongqing,2013125142)Abstract：Antibioticsarebymicroorganisms,(includingbacteria,fungi,actinomycetesspp.)orhigherplantsandanimalsproducedintheprocessoflifewithresistancetopathogensorotheractivityofaclassofsecondarymetabolites,caninterferewithoth

3、erlivingcellsdevelopmentfunctionofchemicalsubstances,duetoitsundernaturalconditionsisnoteasytoget,isnowavailablebyfermentationtoproduceantibiotic,againstthestudentsfermentprocessresearcharereviewed.Keywords:antibiotics;mushroomresidue;processoptimization采用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品是制藥工程的重要部分，其中抗生素是我國醫(yī)藥生產(chǎn)的大宗產(chǎn)品，隨著基

4、因工程技術(shù)的進(jìn)展，基因工程藥的比例逐漸增大，但抗生素在國計(jì)民生中所起的作用是不能完全替代的，特別是西方國家出于能源和環(huán)保的考慮，轉(zhuǎn)產(chǎn)生產(chǎn)高附加值的藥物，留出了抗生素的市場空間，為我國的抗生素生產(chǎn)發(fā)展提供了機(jī)遇，作為一個發(fā)展中的國家，可以說在相當(dāng)長時間內(nèi)，我國抗生素生產(chǎn)在整個醫(yī)藥產(chǎn)品中仍占很大的比例。1全發(fā)酵研發(fā)情況中國最早生產(chǎn)的全發(fā)酵抗生素品種為飼用土霉素鈣。世紀(jì)年代內(nèi)蒙古金河生物科技公司等4家抗生素發(fā)酵企業(yè)開始生產(chǎn)全發(fā)酵金霉素產(chǎn)品，并以內(nèi)蒙古金河生物科技公司的國內(nèi)國際的市場占有量最大。目前國內(nèi)有25家抗生素發(fā)酵生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)全發(fā)酵抗生素產(chǎn)品，產(chǎn)品主要有黃霉素預(yù)混劑、飼用金霉素、那西肽預(yù)混劑、硫

5、酸黏菌素預(yù)混劑、恩拉霉素預(yù)混劑、桿菌肽鋅預(yù)混劑、亞甲基雙水楊酸桿菌肽預(yù)混劑等由于含量規(guī)格不同，目前在我國共獲得70多個產(chǎn)品批準(zhǔn)文號。這些產(chǎn)品對我國的動物養(yǎng)殖發(fā)揮了重要作用主要體現(xiàn)在：治療某些動物疾病；預(yù)防某些動物疾病尤其是對那些傳染性疾病的預(yù)防，保證畜禽的健康生長；促生長作用使畜禽生長速度加快，可使某些飼養(yǎng)動物縮短喂養(yǎng)周期；提高飼料轉(zhuǎn)化率也即飼料利用率，使之利用較少的飼料達(dá)到相同飼喂效果從而節(jié)省飼料提高生產(chǎn)效益提高動物產(chǎn)品質(zhì)量這其中主要是可提高肉蛋奶的產(chǎn)品質(zhì)量提高動物機(jī)能的抵抗力從而增強(qiáng)動物應(yīng)付外界不良環(huán)境的能力。近多年來，我國養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展養(yǎng)殖模式從散養(yǎng)逐步轉(zhuǎn)變集約化養(yǎng)殖，同時我國全發(fā)酵抗生

6、素企業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)和研發(fā)水平也逐步與國際接軌。因此，我國企業(yè)生產(chǎn)的全發(fā)酵抗生素產(chǎn)品在國內(nèi)和國際占有相當(dāng)?shù)氖袌觥＠纾憬Ｕ帢I(yè)股份有限公司生產(chǎn)的恩拉霉素預(yù)混劑一個品種一年的銷售額過億元人民幣。在滿足國內(nèi)市場需求的同時，這些企業(yè)積極開拓國際市場。由于我國能源、人工和原材料成本低，我國生產(chǎn)的全發(fā)酵產(chǎn)品迅速占領(lǐng)國際市場其中金河生物集團(tuán)早在1994年就通過美國對金霉素產(chǎn)品的注冊審批，并先后通過了5次組織的現(xiàn)場檢查。其生產(chǎn)的飼用金霉素產(chǎn)品主要出口到美國。金河生物集團(tuán)、濮陽泓天威藥業(yè)有限公司、浙江升華拜克股份有限公司均已通過澳大利亞APVMA驗(yàn)收可以向澳大利亞、新西蘭等國家地區(qū)供貨。其他幾家企業(yè)生產(chǎn)的飼用

7、金霉素、鹽霉素預(yù)混劑、莫能菌素預(yù)混劑、恩拉霉素預(yù)混劑、桿菌肽鋅預(yù)混劑等產(chǎn)品大量出口北美、亞太以及南美國家。此類全發(fā)酵產(chǎn)品在國際市場上有著穩(wěn)定的市場份額。2國內(nèi)外部分抗生素固態(tài)發(fā)酵研究概況2.1 頭抱菌素C的固態(tài)發(fā)酵早在1984年，中國臺灣的WangHH等1就研究了利用大米來生產(chǎn)頭抱菌素C。他們對發(fā)酵條件進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，得到的條件如下：以大米作為主要基質(zhì)，其中含有0.65%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的蛋白月東,0.65%的硫酸錢，0.26%的肌醇，1.3%（體積質(zhì)量比）的微量元素溶液，0.65%的碳酸鈣，0.65%的硫酸鈣，0.065%的硫酸鉀，1.3%的蔗糖，0.13%的DL-蛋氨酸和2.6%的甲基油

8、酸鹽。初始含水量為49%51%，水活度是0.985，發(fā)酵溫度25C,發(fā)酵時間7d,產(chǎn)量達(dá)到6.42mg/g。JerminiMF和DemainAL2研究了Strepto-mycesclavuligerus和Cephalosporiumacremonium固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)頭抱菌素的條件。S.clavuligerusNR-RL3585用大麥發(fā)酵7d產(chǎn)量達(dá)到300mg/g基質(zhì)，C.acremonium發(fā)酵10d產(chǎn)量達(dá)到950mg/g。K.Adinarayana等冏對用Acremoniumchry-sogenumATCC48272固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)頭抱菌素C的條件進(jìn)行了優(yōu)化。他們對不同的基質(zhì)原料進(jìn)行了選擇，在秋皮、

9、Wheatrawa、Bombayrawa、大麥和米糠中，Wheatrawa最適合頭抱菌素的生產(chǎn)。以Wheatrawa為主要基質(zhì)，對其他條件進(jìn)彳T優(yōu)化如下：Wheatrawa加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的可溶性淀粉,1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的酵母提取物，培養(yǎng)溫度30C,營養(yǎng)鹽按1.5：10（體積質(zhì)量比）的比例加入，接種量10%（體積質(zhì)量比）,初始含水量為80%,初始pH（16.5。在此條件下，頭抱菌素C的產(chǎn)量達(dá)到22.281mg/g。2.2 頭霉素C的固態(tài)發(fā)酵頭霉素C是一種廣譜的3-內(nèi)酰氨類的抗生素，可由多種微生物產(chǎn)生，如Nocardialactamdurans,Streptomycescatteya和S.cl

10、auverigerus。因液態(tài)深層發(fā)酵需要消耗較多的能量，人們開始研究利用固態(tài)發(fā)酵的方法來生產(chǎn)頭霉素CoKrishnaPrasadKota和PadmaSridhar4-5對利用效皮固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)頭霉素C進(jìn)行了研究。固態(tài)發(fā)酵條件為：妹皮5g，棉籽脫脂餅粉5g，葵花籽餅粉5g，玉米漿1g，基質(zhì)初始含水量為80%，初始pH值為6.5,發(fā)酵溫度在2830C,發(fā)酵周期約5d。Streptomycesclavuligerus的生長在第2天看到從第3天開始生成大量菌絲，到第5天時菌絲量達(dá)到穩(wěn)定。頭霉素C在第3天開始生成，在第5天的時候則以15mg/g基質(zhì)的最大速率生成，直到第30天都基本保持穩(wěn)定。研究表明，固

11、態(tài)發(fā)酵所生產(chǎn)的頭霉素C比液態(tài)發(fā)酵方法所產(chǎn)具有更好的穩(wěn)定性，Balkrishnan和Pandey2的研究結(jié)果與此類似。固態(tài)發(fā)酵中頭霉素C產(chǎn)生的最佳溫度和pH都與液態(tài)發(fā)酵中是一致的，但是在固態(tài)發(fā)酵中很難維持恒定的溫度和pH值。2.3 青霉素的固態(tài)發(fā)酵青霉素的固態(tài)發(fā)酵由于其產(chǎn)量較高曾經(jīng)在一段時間受到廣泛關(guān)注，后來隨著液態(tài)深層發(fā)酵水平的提高逐漸被忽視。Barrios-Gonzalez等6證實(shí)了怎樣在短時間內(nèi)用固態(tài)發(fā)酵方法大量地生產(chǎn)青霉素。在液態(tài)發(fā)酵條件下，報道的最大產(chǎn)量為9.8mg/L,而在固態(tài)發(fā)酵條件下，產(chǎn)量為13mg/g,這證實(shí)了固態(tài)發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性和可行性。J.Barrios-Gonzdez等研究了

12、用營養(yǎng)液浸泡甘蔗渣在非無菌條件下固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)青霉素的情況。結(jié)果顯示，這種方法可大大提高青霉素的產(chǎn)量，提高初始含水量到70%有利于青霉素的產(chǎn)生（以后的研究8發(fā)現(xiàn)甘蔗渣、營養(yǎng)物質(zhì)、水三者的比例不同對青霉素的產(chǎn)量影響較大）,與液態(tài)發(fā)酵的比較顯示出一定的優(yōu)越性。在甘蔗渣作支持物固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的研究中，用較大顆粒（14mm）的甘蔗渣可使青霉素的產(chǎn)量提高37%,但這一影響是歸因于蔗渣中較高的糖含量。提高填充密度青霉素的產(chǎn)量可提高20%，如果通氣帶走的水分能及時補(bǔ)充，通氣不會對青霉素的產(chǎn)量產(chǎn)生較大的影響9。3抗生素菌渣資源化再利用3.1 重新用于發(fā)酵替代培養(yǎng)基氮源抗生素菌渣因其含有的豐富的蛋白質(zhì)，含氮量高

13、，可以作為培養(yǎng)基中的氮源。抗生素菌渣用作培養(yǎng)基成分主要有兩種方式：一種是直接將菌渣研磨過篩后用于替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源；一種則是利用酵母菌和芽抱桿菌等對菌渣進(jìn)行固體發(fā)酵，達(dá)到生物改性的目的后，再用在培養(yǎng)基中或者制成如酵母膏之類的高值化培養(yǎng)基成分。抗生素菌渣直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基早在1961年，Ghosh等10通過研究發(fā)現(xiàn)青霉素廢菌渣在不經(jīng)過任何預(yù)處理的情況下，就能用作青霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，并取得了很好的效果。在不減發(fā)酵產(chǎn)青霉素效價的前提下，菌絲體重復(fù)利用的次數(shù)可達(dá)5次。近年來國內(nèi)也有相關(guān)的研究，蔡翔等11研究利用可利霉素菌渣替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源，菌渣作唯一氮源時，加量為4%,效價最高

14、，達(dá)到對照的77%,然后通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，最終可利霉素效價達(dá)到對照的88%。雖然抗生素產(chǎn)量稍有下降，但是生產(chǎn)成本降低，處理方便，同時解決了菌渣處理的難題，保護(hù)環(huán)境。然而抗生素菌渣含有抗生素殘留及有毒代謝產(chǎn)物，散發(fā)異味等不利因素，不但使得適用該處理方式的抗生素菌渣種類較少，而且目前這方面的相關(guān)文獻(xiàn)報道中，某一抗生素菌渣也僅用于該抗生素發(fā)酵，適用性較窄。為此大部分菌渣通常需要進(jìn)行無害化預(yù)處理以及生物改性，使其能更好地應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基。3.2 能源化利用抗生素菌渣含有豐富的生物質(zhì)，故可以同其他生物質(zhì)資源一樣利用厭氧發(fā)酵，熱解或者水熱的方式進(jìn)行能源化利用。厭氧發(fā)酵是將含有高有機(jī)質(zhì)的廢棄物，如豬

15、糞，有機(jī)垃圾、蔬菜廢棄物和秸稈等資源化利用，變廢為沼氣的很好的處理方式，抗生素菌渣含有豐富的有機(jī)質(zhì)，因而可采用厭氧發(fā)酵的方式達(dá)到減量化和資源化的目的，且這種處理方式既減少環(huán)境污染，又獲得了經(jīng)濟(jì)效益。厭氧發(fā)酵處理適用性較廣，可用于多種類型的抗生素菌渣，如紅霉素、林可霉素、青霉素、四環(huán)素、潔霉素和麥迪霉素金12-16但是由于抗生素菌渣C/N比較低，蛋白質(zhì)含量高，故其水解會造成氨氮的積累，氨氮和殘留抗生素是其厭氧發(fā)酵的兩個重要的抑制因素14。過多的氨氮可以通過添加碳源來處理13,抗生素殘留則可通過降解菌或者降解酶預(yù)處理，而且一定濃度抗生素殘留對產(chǎn)甲烷菌存在抑制作用的同時也能對其馴化。劉子旭等17發(fā)現(xiàn)

16、甲烷菌的活性會受到紅霉素的抑制，未投加紅霉素時甲烷的含量為68%,在150mg/L的紅霉素濃度下，甲烷菌的甲烷產(chǎn)量降低約0%,250mg/L時甲烷菌基本喪失活性。通過保持添加20mg/L的紅霉素濃度不變，連續(xù)運(yùn)行60d,初始時甲烷含量下降到49.5%,運(yùn)行20d、40d和60d后甲烷含量呈現(xiàn)遞增趨勢，分別增長至52.6%56%和64.2%。雖未達(dá)到未投加紅霉素的時候的68%的甲烷含量，但僅下降4%。說明通過甲烷菌對抗生素的馴化能力，利用馴化的甲烷菌也能在一定程度上提高厭氧發(fā)酵效果。除此之外，抗生素菌渣用于厭氧發(fā)酵還存在一個問題，菌絲體細(xì)胞壁存在由肽鏈交聯(lián)的多糖成分，不利于生物降解13,因此對菌

17、渣進(jìn)行破壁處理有益于厭氧發(fā)酵。目前對菌渣的預(yù)處理常見的有物理方法：微波法和超聲破碎法；化學(xué)方法：酸熱法和堿熱法。選擇高效且經(jīng)濟(jì)的破壁方式，具有很好的應(yīng)用前景。韓慶等18通過對比微波法、堿熱法和酸熱法對青霉素菌絲體細(xì)胞壁的破壁效果發(fā)現(xiàn)，在相同的時間和溫度條件下，堿熱法的效果最好，且破壁所需的時間相對較短，具有最高的性價比。原因在于細(xì)胞壁主要由甲殼素、葡萄糖及聚糖醛酸等物質(zhì)組成，這些物質(zhì)大多在堿性條件不穩(wěn)定，所以在堿性環(huán)境中破壁效果最好19。Zhong等13通過對鏈霉素菌渣進(jìn)行堿熱預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)器的生產(chǎn)性能和甲烷產(chǎn)量提高22.08%-27.08%，菌渣去除率達(dá)到64.09%，總揮發(fā)性脂肪酸和氨氮

18、的積累量都有所下降。因此，通過對菌渣進(jìn)行合適的預(yù)處理，對其進(jìn)行厭氧發(fā)酵實(shí)現(xiàn)菌渣減量化和能源化利用具有廣闊的前景，同時厭氧發(fā)酵后的廢渣，經(jīng)過安全性分析后可用于農(nóng)肥，實(shí)現(xiàn)綜合利用。熱解液化處理是在缺氧和高溫條件下處理有機(jī)物，將其由大分子分解成為小分子，甚至是氣體，主要獲得生物油資源和部分燃?xì)饧敖固?0。水熱法則是以高溫的液態(tài)水作為反應(yīng)介質(zhì)，將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成燃?xì)狻⑸镉秃徒固康取Ｋ疅岱ê蜔峤夥ǘ寄芎芎玫貙M(jìn)行無害化處理，不同的是水熱法的能效更高，所得油品的熱值也更高，更易于制成液體燃料。張光義等21研究利用水熱法處理頭抱菌素C制備固態(tài)燃料過程中的特性，表明水熱處理能對菌渣進(jìn)行無害化處理，并實(shí)現(xiàn)多重

19、效益。但由于水熱處理存在條件要求苛刻，設(shè)備成本高，反應(yīng)時間長等問題，應(yīng)用受到很大的限制，目前水熱技術(shù)還未得到推廣應(yīng)用。4過程優(yōu)化控制理論的應(yīng)用及其發(fā)展抗生素發(fā)酵過程優(yōu)化的另一重要內(nèi)容就是各種控制理論的應(yīng)用。早在上世紀(jì)中葉，人們?yōu)榱搜芯课⑸镞^程特性，開展以微生物細(xì)胞生長、代謝及有關(guān)產(chǎn)物形成等動力學(xué)研究，先后建立了Monod、Contois等數(shù)學(xué)模型，隨著以生產(chǎn)為目的的發(fā)酵過程優(yōu)化技術(shù)的研究深入，特別是對細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的深入研究和對以分批培養(yǎng)為主要對象的發(fā)酵過程參數(shù)的時變性、多樣性、耦合性和不確定性的認(rèn)識，在過程動力學(xué)數(shù)學(xué)*II型為基礎(chǔ)上，引進(jìn)了一系列現(xiàn)代控制理論22-24,其中有靜態(tài)和動態(tài)

20、優(yōu)化、系統(tǒng)識別、自適應(yīng)控制、專家系統(tǒng)、模糊控制、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)等。這種適應(yīng)發(fā)酵過程非線性特征的研究方法為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究的深入開展以及提高學(xué)術(shù)研究水平起了很大的推進(jìn)作用，但在實(shí)際工廠生產(chǎn)上仍有很大局限性。造成這種局限性的原因除發(fā)酵過程的高度非線性的多容量特性彳艮難用一組線性或擬線性數(shù)學(xué)模型來精確描述外，如何實(shí)現(xiàn)從宏觀描述到微觀研究也是一個重要原因。本文提出的在發(fā)酵過程研究中應(yīng)該重視細(xì)胞代謝流的問題實(shí)質(zhì)上就屬這種性質(zhì)的問題。從控制論來看，當(dāng)前一個熱點(diǎn)課題之一就是混沌現(xiàn)象的研究25。在我們進(jìn)行抗生素發(fā)酵研究時，常發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期表現(xiàn)出過程的多態(tài)性和不穩(wěn)定性，輸入的初始條件的極細(xì)微的差別會產(chǎn)生結(jié)果的巨

21、大變化，這就是所謂發(fā)酵過程的混沌現(xiàn)象。混沌是非線性系統(tǒng)所特有的一種運(yùn)動形態(tài)，它是確定性系統(tǒng)里由于內(nèi)部隨機(jī)性而產(chǎn)生的貌似無序的復(fù)雜運(yùn)動。但上述關(guān)于混沌現(xiàn)象的研究只是停留在對微生物過程混沌現(xiàn)象的揭示與表征，對導(dǎo)致生物系統(tǒng)出現(xiàn)混沌現(xiàn)象的微觀機(jī)理未做任何涉及。任何生物現(xiàn)象問題必需要從細(xì)胞生物學(xué)角度找原因，這是近年來生物技術(shù)發(fā)展的共識，因此我們認(rèn)為，如何從微觀認(rèn)識來解釋上述現(xiàn)象對抗生素發(fā)酵過程優(yōu)化與放大研究將具重要意義。這也是當(dāng)前化學(xué)工程與生物技術(shù)深度結(jié)合形成生物化工的新特點(diǎn)：由宏觀邁向微觀，強(qiáng)調(diào)在生物技術(shù)深入發(fā)展的基礎(chǔ)上以微尺度的工程學(xué)觀點(diǎn)研究過程特性。例如有人研究認(rèn)為在發(fā)酵初期菌體處于對數(shù)生長階段時

22、，在數(shù)學(xué)模型研究時隨著引入階數(shù)的增加，菌體濃度隨著滯后時間的增大已經(jīng)有了明顯的振蕩，不再表現(xiàn)為單純指數(shù)型生長，若此時發(fā)酵過程出現(xiàn)底物限制或產(chǎn)物抑制，以及代謝途經(jīng)或調(diào)控操作等的改變，發(fā)酵過程將會發(fā)生周期、倍周期分岔直至混沌，就顯示出過程的多態(tài)性和不穩(wěn)定性。我們在紅霉素與金霉素等抗生素發(fā)酵研究時,發(fā)現(xiàn)早期CER、pH、DO、OUR、RQ有一個相對應(yīng)的上升峰或下降峰，反映了發(fā)酵初期的系統(tǒng)特征，并進(jìn)一步通過在線計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集的RQ值變化，發(fā)現(xiàn)在一定時期有機(jī)氮源同時被作為碳源使用，即以碳氮骨架通過氨基酸進(jìn)入到菌體，如這時控制不恰當(dāng)，就會發(fā)生抗生素生產(chǎn)能力的大起大落，即所謂混沌現(xiàn)象。經(jīng)初步研究和有關(guān)文獻(xiàn)報

23、道，發(fā)現(xiàn)可能是原核細(xì)胞中的一種普遍的代謝調(diào)控機(jī)制：嚴(yán)謹(jǐn)響應(yīng)(stringentresponse)26,27。即當(dāng)生長環(huán)境中的氨基酸成為限制條件時，空載tRNA水平升高，當(dāng)空載tRNA進(jìn)入核糖體后，啟動嚴(yán)謹(jǐn)響應(yīng)因子，同時伴隨著菌絲分化現(xiàn)象及次級代謝產(chǎn)物合成的啟動。這種狀態(tài)反映了基因表型和細(xì)胞代謝特征的變化，控制混沌可以得到我們所需要的細(xì)胞生理狀態(tài)，有可能對提高抗生素發(fā)酵效價具有重要意義。參考文獻(xiàn).1 .WANGHH,CHIOUJY,WANGJY,etal.Ceph-alosporinCproductionbysolidstatefermentationwithricegrainsJ.ChinJM

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