1、單成彬制作單成彬制作五、熒光的細胞化學測定五、熒光的細胞化學測定 一、實驗目的一、實驗目的 學習熒光顯微鏡的使用，了解熒光學習熒光顯微鏡的使用，了解熒光顯微技術原理和方法，以及熒光技術在顯微技術原理和方法，以及熒光技術在細胞化學方面的應用。細胞化學方面的應用。 二、實驗原理二、實驗原理 熒光顯微技術是利用短波光照射被射物質，以激發其發射熒光熒光顯微技術是利用短波光照射被射物質，以激發其發射熒光而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。 熒光又可分為：自發熒光和次生熒光。自發熒光是指有些生物熒光又可分為：自發熒光和次生熒光。自發熒光是指有些生物體受到短波光照射后，直接發出的

2、熒光。如經紫外光照射后，葉綠體受到短波光照射后，直接發出的熒光。如經紫外光照射后，葉綠體發出的紅色熒光；木質素發出的黃色熒光等。次生熒光是指有些體發出的紅色熒光；木質素發出的黃色熒光等。次生熒光是指有些生物材料受到短波光照射后并不發光，但當它吸附熒光染料后，也生物材料受到短波光照射后并不發光，但當它吸附熒光染料后，也同樣產生熒光，這種熒光也稱間接熒光。同樣產生熒光，這種熒光也稱間接熒光。 作為熒光的激發光源可分別采用紫外，紫、藍、綠等作為熒光的激發光源可分別采用紫外，紫、藍、綠等波段的光；而獲得的熒光為紫、藍、綠、黃、橙、紅等波波段的光；而獲得的熒光為紫、藍、綠、黃、橙、紅等波段的光。不同生理

3、活性的細胞，發射熒光段的光。不同生理活性的細胞，發射熒光(或次生熒光或次生熒光)的的能力有很大差別，不同組份對熒光染料反應產生的熒光顏能力有很大差別，不同組份對熒光染料反應產生的熒光顏色也不同，所以利用這一特性，通過熒光顯微鏡可以測定色也不同，所以利用這一特性，通過熒光顯微鏡可以測定某些組分的含量。以及細胞的生理活性。某些組分的含量。以及細胞的生理活性。 三、實驗用品三、實驗用品 (一一)材料：洋蔥材料：洋蔥 (二二)用品：熒光顯微鏡，載玻片，鑷子，燒杯等。用品：熒光顯微鏡，載玻片，鑷子，燒杯等。 (三三)試劑：試劑： (1) O.01 吖啶橙生理鹽水溶液吖啶橙生理鹽水溶液 (2) O.02

4、異硫氰酯熒光素生理鹽水溶液異硫氰酯熒光素生理鹽水溶液 (3) O.Ol 羅丹明生理鹽水溶液羅丹明生理鹽水溶液 (4) 熒光增白劑溶液，將熒光增白劑溶于熒光增白劑溶液，將熒光增白劑溶于0.4M山梨醇液中，使山梨醇液中，使 濃度達到濃度達到0.1。四、實驗方法四、實驗方法 (一一)利用熒光增白劑觀察植物細胞壁利用熒光增白劑觀察植物細胞壁 植物細胞壁有強烈的吸附染料的能力，因此很植物細胞壁有強烈的吸附染料的能力，因此很多熒光染料都能著染細胞壁，但近年來最常用的還多熒光染料都能著染細胞壁，但近年來最常用的還是熒光增白劑，以此來鑒別細胞壁的狀況，并常用是熒光增白劑，以此來鑒別細胞壁的狀況，并常用于檢查原

5、生質體細胞壁是否分解完全，以及原生質于檢查原生質體細胞壁是否分解完全，以及原生質體再生細胞壁的鑒別。體再生細胞壁的鑒別。 1取洋蔥表皮細胞取洋蔥表皮細胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以熒光增白劑染色熒光增白劑染色5分鐘，加蓋玻片，熒光顯微分鐘，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察其細胞壁。鏡下觀察其細胞壁。 2取以酶液游離出來的原生質體懸液取以酶液游離出來的原生質體懸液l滴于滴于載玻片上，加熒光增白劑一滴，染色載玻片上，加熒光增白劑一滴，染色 5分鐘，加分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察原生質體脫壁是否完蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察原生質體脫壁是否完全，藍紫光激發觀察。全，藍紫光激發觀察。 (二二

6、) DNA分布的觀察分布的觀察 取洋蔥內表皮細胞取洋蔥內表皮細胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.0l吖啶橙吖啶橙染色染色5分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍光激發觀察。藍光激發觀察。 （三（三) 蛋白質分布的觀察蛋白質分布的觀察 取洋蔥內表皮細胞取洋蔥內表皮細胞(1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.02異硫氰酯熒光素染色異硫氰酯熒光素染色510分鐘，生理鹽分鐘，生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍光激水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下藍光激發觀察。發觀察。（四（四) 線粒體觀察線粒體觀察 取洋蔥內表皮細胞取洋蔥

7、內表皮細胞 (1cm2)置于載玻片，以置于載玻片，以0.0l羅丹明染色羅丹明染色5分鐘生理鹽水沖洗一次，加蓋分鐘生理鹽水沖洗一次，加蓋玻片，熒光顯微鏡下綠光激發觀察。玻片，熒光顯微鏡下綠光激發觀察。 五、作業五、作業 分別描述分別描述DNA，蛋白質及線粒體在細胞內的，蛋白質及線粒體在細胞內的分布與顏色。分布與顏色。實驗六實驗六 細胞活力的測定細胞活力的測定 一、實驗目的一、實驗目的 學習熒光顯微鏡的使用，了解熒光學習熒光顯微鏡的使用，了解熒光顯微技術原理和方法，以及熒光技術在顯微技術原理和方法，以及熒光技術在細胞化學方面的應用。細胞化學方面的應用。 二、實驗原理二、實驗原理 熒光顯微技術是利用

8、短波光照射被射物質，以激發其發射熒光熒光顯微技術是利用短波光照射被射物質，以激發其發射熒光而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。而在熒光顯微鏡下可以檢視的方法。 熒光又可分為：自發熒光和次生熒光。自發熒光是指有些生物熒光又可分為：自發熒光和次生熒光。自發熒光是指有些生物體受到短波光照射后，直接發出的熒光。如經紫外光照射后，葉綠體受到短波光照射后，直接發出的熒光。如經紫外光照射后，葉綠體發出的紅色熒光；木質素發出的黃色熒光等。次生熒光是指有些體發出的紅色熒光；木質素發出的黃色熒光等。次生熒光是指有些生物材料受到短波光照射后并不發光，但當它吸附熒光染料后，也生物材料受到短波光照射后并不發光，但當它吸附熒

9、光染料后，也同樣產生熒光，這種熒光也稱間接熒光。同樣產生熒光，這種熒光也稱間接熒光。 三、實驗用品三、實驗用品 (一一) 材料：新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆原生質體懸液，人口腔上皮細材料：新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆原生質體懸液，人口腔上皮細胞。胞。 (二二) 用品：熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，燒杯，牙簽等。用品：熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，燒杯，牙簽等。 (三三) 試劑：試劑： 1二丙酸酯熒光素溶液：取二丙酸酯熒光素溶液：取l0mg二丙酸熒光素于二丙酸熒光素于5ml丙酮中，將丙酮中，將此溶液逐滴加入此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理鹽水或生理鹽水或0.65M的甘露醇溶液中，直到的甘露醇溶

10、液中，直到出現永久性乳白沉淀為止。出現永久性乳白沉淀為止。 20.01吖啶橙的生理鹽水溶液。吖啶橙的生理鹽水溶液。四、實驗方法四、實驗方法 (一一) 細胞二丙酸酯熒光素分解酶的活性及細胞活力的測細胞二丙酸酯熒光素分解酶的活性及細胞活力的測定二丙酸酯熒光素是非熒光性的親酯性化合物，很容易進定二丙酸酯熒光素是非熒光性的親酯性化合物，很容易進入細胞活力較強的細胞內，由于細胞內有較強的活性酯酶入細胞活力較強的細胞內，由于細胞內有較強的活性酯酶而將二丙酸酯熒光素中的熒光素分解出來，從而在熒光顯而將二丙酸酯熒光素中的熒光素分解出來，從而在熒光顯微鏡下發出了強烈的黃綠熒光，相反活力較弱的細胞，由微鏡下發出了

11、強烈的黃綠熒光，相反活力較弱的細胞，由于酯酶的含量低，表現熒光較弱，而死亡的細胞，由于酯于酯酶的含量低，表現熒光較弱，而死亡的細胞，由于酯酶活性喪失，不能分解二丙酸酯熒光素，而完全沒有熒光，酶活性喪失，不能分解二丙酸酯熒光素，而完全沒有熒光，具體方法如下：具體方法如下： 1取少許新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆取少許新鮮紫鴨趾草花粉或蠶豆表皮放在玻片上，加二丙酸酯熒光素溶表皮放在玻片上，加二丙酸酯熒光素溶液一滴，液一滴，5-10分鐘后，在熒光顯微鏡下分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察，時間不宜太長，以免細胞逐漸死觀察，時間不宜太長，以免細胞逐漸死亡，影響效果亡，影響效果 。2若著染是懸浮細胞，可將上述染色液數滴

12、直接加若著染是懸浮細胞，可將上述染色液數滴直接加入細胞培養液入細胞培養液5分鐘后，可離心收集。再用無細胞和分鐘后，可離心收集。再用無細胞和無染料的培養液洗二次，即可收集觀察。上述染過無染料的培養液洗二次，即可收集觀察。上述染過的細胞可保存在的細胞可保存在4左右的冰箱中，直到細胞死亡前左右的冰箱中，直到細胞死亡前故可觀察。故可觀察。 細胞經吖啶橙染色，在激發光作用下，活細胞核呈黃綠細胞經吖啶橙染色，在激發光作用下，活細胞核呈黃綠色或亮綠色熒光，而細胞質為淡紅色，但含有粘多糖的細胞色或亮綠色熒光，而細胞質為淡紅色，但含有粘多糖的細胞在其細胞質中出現桔黃色顆粒，或整個細胞質呈桔黃桔紅色在其細胞質中出現桔黃色顆粒，或整個細胞質呈桔黃桔紅色熒光，死細胞其核呈紅色熒光其操作方法如下：熒光，死細胞其核呈紅色熒光其操作方法如下： 用牙簽取少許口腔粘膜上