1、二苯乙烯昔通過抑制的Beclin-1、LC3-H表達改善APP695V717I轉基因鼠的行為學障礙羅紅波，石向群，郭建魁，張志強，汪泳，李蕓，尹榕（蘭州軍區蘭州總醫院神經內科，甘肅省蘭州市730050）【摘要】目的探討在APP695V7171轉基因鼠模型中，二苯乙烯苜（TSG）對大鼠行為學的保護作用及其對自噬分子Beclin-1、LC3-H的表達影響。方法選取10月齡APP695V717I轉基因小鼠40只，隨機數字表法分為藥物組組、模型組，各20只，藥物組給予TSG灌胃1個月，同背景同月齡C57BL/6J小鼠為正常對照組。行為學檢測應用Morris水迷宮實驗和Y電迷宮實驗。反轉錄聚合酶鏈反應及

2、免疫印跡法檢測海馬神經元自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-皿的mRNA及蛋白表達變化。結果在模型組中，大鼠Y電迷宮躲避所需的電刺激次數增加，Morris水迷宮測試中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數減少；Beclin-1和LC3-H的mRNA及蛋白的表達增高，與對照組比較有統計學意義（P0.05）;TSG藥物十預后，大鼠躲避所需的電刺激次數減少，潛伏期縮短，游泳路程縮短，穿越平臺次數增加；Beclin-1和LC3-皿的mRNA及蛋白的表達較模型組下降（P0.05）,差異有統計學意義。結論二苯乙烯苜可通過下調自嗜通路中Beclin-1和LC3-H的表達，以抵抗A6的神經蠹性作用對內質網功

3、能的損害，從而改善大鼠的學習記憶、空間定向等行為學表現。【關鍵詞】APP轉基因小鼠；自噬；二苯乙烯苜；行為學阿爾茨海默病（AlzheimersdiseaseAD）是一種神經系統變性疾病，其主要的病理學特征之一是腦組織中出現大量老年斑1。老年斑主要由6-淀粉樣蛋白（6-amyloid,A6）形成,A6是通過淀粉樣樣前體蛋白（APP）的異常剪切、折疊后所形成，在細胞內，對這種異常折疊的蛋白質，細胞可通過泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasomepathway,UPP）和自噬溶酶體途徑來調控蛋白、細胞器的降解，從而保證蛋白質的正常工作，維持細胞功能的正常運行。有學者早期研究發現AD患

4、者在病理上表現為大量囊泡的堆積，但這種表現的機制及其在AD發病機制中的作用卻沒有得到明確的闡述；2006年，有學者建立自噬途徑的重要蛋白Apg5/Apg7基因敲除的大鼠模型，發現該模型表現出神經變性疾病的一些表型，使得自噬途徑在神經變性疾病得到了關注和重視2-3。本實驗采用APP695V717I轉基因AD動物模型觀察大鼠海馬神經元自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-II的表達情況并探討其意義。AD患者的學習記憶及工作能力的逐漸喪失給家庭及社會帶來沉重的負擔，但目前其治療尚無十分有效方法與藥物。研究顯示何首烏的主要有效成分之一（2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-0-6-D葡萄糖苜（2,3,5

5、,4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside,二苯乙烯苜,TSG）能減少6-淀粉樣肽誘導的老年斑沉積，改善癡呆模型大鼠學習記憶能力，降低淀粉樣前體蛋白（APP）的表達水平。我們通過觀察APP695V7171轉基因鼠的行為學表現及自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-H在海馬的表達情況并探討其意義，進一步揭示AD新的發病機制，以及何首烏提取物二苯乙烯苜治療AD的主要作用機制及藥物靶點。材料和方法一、材料1. 實驗動物分組及十預：10月齡APP695V717I轉基因小鼠40只，雌雄各半（許可證號01-3001）,及20只年齡匹配的同背景C57BL/6J小鼠，雌雄各半（作

6、為正常對照），均購自中國醫學科學院實驗動物研究中心。轉基因小鼠隨機數字表法分為TSG組、模型組，各20只。藥物組給予TSG灌胃1個月，每天1次，灌胃量按5ml/kg計算。正常對照組給予生理鹽水灌胃。2. 主要試劑和藥物：Beclin-1和LC3-皿一抗購于Stressge公司；引物自行設計，由上海華大基因有限公司合成；Trizol、TacB、逆轉錄酶購自MBI公司。二苯乙烯苜為從何首烏中提取分離的干粉，含量為68%(湖南中醫藥研究所提供)，實驗時用水溶解為100mg/kg的濃縮液。二、方法刪掉“大鼠模型的建立、取材及干預”行為學檢測：(1)Y電迷宮電擊實驗：電擊次數表示其學習記憶的獲得能力，記

7、錄每只大鼠學會逃避電刺激次數，以30次為最大值計數。(2)Morris水迷宮定位航行實驗(PNT):每天08:00-11:00之間對每只大鼠進行訓練，不選平臺所在象限作為入水點，按順時針方向把大鼠面向池壁放入水中，檢測大鼠隱匿平臺潛伏期。如果在規定的最長時間120s內未到達平臺，則由實驗者將其引至平臺，逃避潛伏期記為120s,大鼠在平臺休息20s后進行下一次測試。觀察并記錄動物找到并爬上平臺的潛伏期、游泳路程及游泳軌跡。3d訓練結束后將大鼠按組別進行造模。丁制模后21dH行PNT。(3)Morris水迷宮空間探索試驗(SPT):各組大鼠最后一次PNT后撤除平臺，將大鼠從最后1次入水點面向池壁放

8、入水中，使大鼠在水迷宮中連續游泳，記錄大鼠120s內穿越原平臺平面的次數。1. 超微結構檢測：分離海馬組織后，磷酸鹽緩沖夜(PBS)洗滌2次，4%戊二醛固定，冷卻后切塊，2%餓酸固定，梯度丙酮脫水，浸泡，包埋，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測mRNA表達：依據Medline基因文庫自行設計引物，目的基因Beclin-1(162bp),上游弓I物：5-CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3，下游弓I物：5-ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3;目的基因LC3-U(136bp),上游弓I物：5-ACCAAGCCTTC

9、TTCCTCC-3，下游引物:5-TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3;內參照6-actin(100bp),上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3下游引物：5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。產物經瓊脂糖凝膠電泳，于紫夕卜投射燈下觀察結果并拍照。2. 免疫印跡法(Westernblot)測蛋白表達：密度梯度離心法提取蛋白，將海馬組織轉移到勻漿器中，加裂解液勻漿，離心10min(2400r/min,半徑13.5cm)，取上活，繼續離心15min(轉速12000r/min,半徑13.5cm),取上札再離心30min(15000r/min,半

10、徑13.5cm)，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，用二奎琳甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度；樣品與等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性，用10%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉移蛋白至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，與一抗孵育，加入辣根過氧化物酶標記二抗孵育，ECL試劑盒進行化學發光檢測，JS-300凝膠圖像儀掃描分析處理。三、統計學方法數據用SPSS12.瞅件處理。計量資料用又s表示，兩組問比較用t檢驗，多組獨立樣本比較用方差分析。結果刪掉“模型組大鼠腦組織切片染色結果”一、Y電迷宮檢測與對照組比較，模型組躲避電刺激數明顯增加(t=10.0884,P0.01),

11、藥物組躲避電刺激數增加(t=2.7781,P0.05),差異有統計學意義；與模型組比較，經TSG干預，藥物組學會躲避所需的電刺激顯著減少(t=11.1755,P0.01),差異有統計學意義(表1)。二、Morris水迷宮檢測與對照組相比，模型組和藥物組小鼠的Morris水迷宮測試游泳潛伏期(t=14.4648,P0.01)及路程均增加(t=5.6550,P0.01)，穿越平臺次數下降明顯(t=15.5895,P0.01),差別隨時間的延長而加大；與模型組比較，藥物組的潛伏期縮短(t=5.5023,P0.01)，游泳路程縮短(t=2.2341,P0.05)，穿越程臺次數增加(t=4.8163,P

12、0.01),差異具有統計學意義。見表1表1大鼠水迷宮行為學比較比較(xS)n()()()對照組2017.03+1.233.96+1.0518.13+4.15模型組2032.15+4.51a8.30+3.02a3.09+1.18a藥物組2025.26+3.76ab6.08+3.26ac4.82+1.09ac注：與對照組比較：aPV0.05；與模型組比較：cPV0.05三、大鼠海馬CA1區電鏡下自噬現象對照組：神經細胞胞膜完整，胞漿基質電子密度均勻，胞漿內線粒體結構活晰可見，細胞質內線粒體及粗面內質網豐富，結構大致正常，線粒體峪活楚、完整，核圓、核膜完整活晰，高爾基體無改變。模型組：胞漿內線粒體結

13、構欠活楚，峪消失，少數呈空泡樣變，粗面內質網結構欠活晰，部分擴張，核膜較模糊不活，高爾基體大致正常，見圖2;胞內可見大量自嗜泡形成,見圖3藥物組：胞漿內線粒體結構尚活楚，少數可見峪消失，空泡樣變很少見，粗面內質網結構尚活晰，少數見輕度擴張，偶見個別胞漿水腫，核膜尚完整，高爾基體正常，見圖4。圖2電鏡X6000倍圖3電鏡X6000倍圖4電鏡X6000倍四、自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-皿的mRNA及蛋白表達如圖5/6/7所示，將RT-PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并采用蛋白質印跡方法分析，可見模型組的Beclin-1、LC3-UmRNA與其蛋白的表達趨勢一致，與對照組比較，差異有統

14、計學意義(P=0.000.05);TSG組在Beclin-1、LC3-U蛋白表達明顯降低，與模型組比較有顯著性差異(P=0.000.05),排除手術因素干擾。見圖8。表2大鼠Beclin-1、LC3-n的mRNA及蛋白相對表達(Xs,%)組別例數mRNA的相對表達%Beclin-1LC3-nBeclin-1LC3-對照組200.25+0.010.23+0.030.20+0.010.26+0.02模型組20a0.58士0.01a0.42士0.01a0.63士0.01a0.52+0.01藥物組20,ab0.41+0.02,ab0.34+0.01,ab0.49+0.02,ab0.36+0.02注：與

15、對照組比較：aPv0.05;與模型組比較：bPv0.05;Beclin-1actinABCD圖5:Beclin-1/6-actin的mRNA表達圖A:對照組B:藥物組C:模型組LC3-n3-actinABCD6:LC3-n/6-actin的mRNA表達A:對照組B:藥物組C:模型組圖7:Beclin-1、LC3-n/6-actin的蛋白表達A:對照組B:藥物組C:模型組老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimers,AD)的主要組織病理變化，而6-淀粉樣肽(6-amyloid,A6)是老年斑的主要成分，因此，A6的神經蠹性是AD形成和發展的關鍵因素。A6由3943個氨基酸組成，來源丁淀粉樣前體蛋白

16、(Amyloidprecursorprotein,APP),如果各種危險因素導致APP的異常剪切,A6的空間構象發生改變，就會導致A6異常聚集而產生神經蠹性作用4。正常情況TAP的空間二級結構以a螺旋為主，聚集性較弱，可被蛋白酶水解；如果A6構象發生錯誤折疊，轉變為6折疊時，聚集性較弱，不易被蛋白酶水解，進而形成組織沉淀并誘導神經元凋亡。因此，在分子水平上，AD勺疾病本質是一種神經變性構象病，一種蛋白錯誤折疊并聚集的“蛋白構象病”。蛋白構象病的相同點是異常蛋白在細胞內蓄積，而這些蛋白主要是依賴自噬途徑被降解，提示自噬障礙可能參與了神經退行性疾病的發病。自噬溶酶體途徑可能通過活除細胞內產生的細胞

17、蠹性物質、失活的細胞器，再循環利用細胞中的氨基酸、核普酸等成分，減少對細胞的損害，從而有利丁挽救瀕臨死亡的細胞。LC3和Beclin-1是參與自噬體形成的特異性的重要基因5。LC3-U定位丁前自噬體和自噬體，使之成為自噬體的標志分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內的LC3-U即被溶酶體中的水解酶降解。LC3-U含量的多少與自噬泡數量的多少成正比，可通過檢測細胞內LC3-皿的含量變化，來判斷細胞狀態，判斷其自噬是被誘導還是被抑制6。而Beclin-1還是參與自噬調控的重要基因，它可以通過提高細胞自噬來抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因，其不僅與自噬調控通路有關，而且涉及細胞凋亡的調控，可能同

18、時參與兩種程序性細胞死亡過程7。因此，本研究用LC3-H和Beclin-1作為細胞發生自吞噬的標志分子。在實驗中，WesterrftRT-PCR的結果顯示，轉基因小鼠的模型組海馬部位LC3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達均明顯增高，說明APP轉基因小鼠產生的A6啟動自噬通路；推測A0在形成纖維化的過程中產生的神經蠹性可導致內質網功能障礙，細胞通過內質網自穩系統的調節，促進細胞內自噬來平衡應激狀態A6,其前體6CTF、APP,及丫分泌酶。用丫分泌酶能從內質網中轉移至自噬體中，而也有觀點認為自噬溶酶體途徑是產生蠹性A6的一個重要過程。在體內和體外試驗中，Yu等8和LeBlanc等9發現在自噬

19、體內存在rapamycin或去血活等方法來增強自噬功能后，A6的產生也大大增加。Haass等10研究發現細胞內A6對細胞的損傷遠遠大于細胞外A6的作用。此外，通過自噬溶酶體途徑產生的A6,可以通過溶酶體降解，也可以被分泌到細胞外形成不可溶的異常聚集體。這些提示自噬溶酶體途徑障礙可能導致蠹性A6的產生增多，導致神經元的損傷和細胞外老年斑的形成。在前期的實驗中我們發現A6誘發的內質網應激及相關的凋亡通路參與A6神經蠹性對腦的神經元損傷機理11。而目前的研究也發現內質網應激時PERK信號通路促使某些蛋白質如多聚谷氨酰胺polyQ72在內質網中大量堆積，抑制內質網相關降解系統；同時磷酸化eIF2a,上

20、調Atg12(autophagyprotein12形成Atg5-Atg12-Atg16復合物，引起LC3蛋白質的膜轉位誘發自噬12。結合本實驗結果并回顧文獻，我們認為在AD的發病中，當A6被細胞分泌至細胞外，形成纖維化的過程中，所表現的神經蠹性開始起作用，A6可破壞細胞膜誘發氧化應激，氧化應激乂會破壞內質網功能，引起的內質網應激在短時間內通過啟動未折疊蛋白保護通路如PERK等來保護對大腦造成的損傷，同時內質網的應激也使細胞內產生的蛋白在內質網中錯誤折疊的幾率增加，導致了錯誤蛋白的異常剪切和積聚，這些異常剪切的蛋白可啟動細胞的LC3、Beclin-1自噬通路，但當自噬無法降解過多的蛋白質時，這部

21、分細胞可能因為這種過度的應激導致通過特異性的內質網Caspase1況亡途徑發生死亡。因此可見，分泌至細胞外的A6可誘導細胞內產生更多的異常剪切和積聚的蛋白，這些錯誤折疊的蛋白即可誘發內質網介導的凋亡，也可以通過自噬途徑使細胞程序性死亡，出現AD的病理學改變及進行性加重的行為學障礙。對中藥何首烏的相關研究表明，何首烏能改善AD模型大鼠學習記憶能力，對膽堿能神經投射纖維有保護作用，可提高乙酰膽堿酯酶活性，可通過調節凋亡相關基因Bax/Bcl-2通路抑制細胞凋亡13-16。因此，對何首烏的主要有效成分二苯乙烯苜進行研究，進一步揭示其治療AD的主要作用機理及藥物靶點。在Morris水迷宮實驗中，PNT

22、主要考察大鼠的空間分辨學習能力，SPT主要測量大鼠的工作記憶能力，通過本實驗可以看出，在A6蠹性作用下，轉基因鼠的學習記憶、空間定向、工作記憶能力明顯下降，表現為Y電迷宮躲避所需的電刺激次數增加，Morris水迷宮測試中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數減少；從時間上來看，這種損害隨著A6暴露時間的延長而加重，說明A6對小鼠的學習記憶、空間記憶及工作記憶的損害呈逐漸增強的累加效應；經TSG十預后，小鼠躲潛伏期縮短，游泳路程縮短，穿越平臺次數增加，說明TSG可改善模型小鼠學習記憶、空間定向、工作學習能力，具有腦保護作用。Western和RT-PCR的結果顯示，藥物組經TSG十預后，海馬部位L

23、C3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達均降低。有研究提示TSG可以下調APP的表達，我們的前期實驗證實TSG可以緩解內質網應激程度，減少內質網應激分子伴侶GRP78的表達和Caspase12誘導的凋亡11。因此，中藥何首烏提取物TSG可以明顯改善AD鼠的學習記憶、空間定向等行為學功能，其作用機制可能通過抑制淀粉樣前體蛋白的表達，減輕A6的神經蠹性對內質網功能的損害，緩解內質網應激程度，從而使自嗜通路中Beclin-1、LC3-U的表達下調，細胞的自嗜和凋亡等減少，從而起到改善AD鼠行為學障礙的腦保護作用。參考文獻1 QuerfurthHW，LaFerlaFM.Alzheimersdisea

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