1、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定微量凱氏定氮法(micro Kjeldahl method)生物材料的含氮量測(cè)定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，如蛋白質(zhì)的含氮量約為16，測(cè)出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測(cè)定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測(cè)定準(zhǔn)確度高，可測(cè)定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因而被公認(rèn)為是測(cè)定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法.實(shí)驗(yàn)原理生物材料的含氮量測(cè)定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，如蛋白質(zhì)的含氮量約為16，測(cè)出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測(cè)定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測(cè)定準(zhǔn)確度高，可測(cè)定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因

2、而被公認(rèn)為是測(cè)定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。其原理如下：1. 消化：有機(jī)物與濃硫酸供熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮硫酸銨。為加快反應(yīng)，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。這一步約需30min至1h，視樣品的性質(zhì)而定。2. 加堿蒸餾：硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH, 加熱后生成NH3, 通過(guò)蒸餾導(dǎo)入過(guò)量酸中和生成NH4Cl而被吸收。3. 滴定：用過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)HCl吸收NH3，剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由所用HCl摩爾數(shù)減去滴定耗去的NaOH摩爾數(shù)，即為被吸收的NH3摩爾數(shù)。此法為回滴法，采用甲基紅衛(wèi)指示劑。HClNaOHNaC

3、l +H2O本法適用于0.2 2.0 mg的氮量測(cè)定。1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應(yīng)室 8. 反應(yīng)室外殼 9. 夾子 10. 反應(yīng)室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網(wǎng)微量凱氏蒸餾裝置示意圖試劑和器材一、試劑濃硫酸；30過(guò)氧化氫溶液；10 M氫氧化鈉；0.01M的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸；標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨（0.3mg氮/mL）催化劑：硫酸銅：硫酸鉀1：4混合，研細(xì)。指示劑：0.1甲基紅乙醇溶液。二、測(cè)試樣品牛血清白蛋白。三、器材微量凱氏定氮儀；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（

4、15;1）; 燒杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角燒瓶150mL（×4）；凱氏燒瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；電爐；分析天平。操作方法一、樣品處理稱取牛血清白蛋白50mg，加入2個(gè)凱氏燒瓶中，另2個(gè)凱氏燒瓶為空白對(duì)照，不加樣品。分別在每個(gè)凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀硫酸銅混合物，再加5 mL濃硫酸。二、消化將以上4個(gè)凱氏燒瓶置于通風(fēng)櫥中電爐上加熱。在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化,使瓶?jī)?nèi)液體微微沸騰，大約維持2 3h。待消化液變成

5、褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30過(guò)氧化氫溶液1 2滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續(xù)消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍(lán)綠色，消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸餾水洗滌燒瓶數(shù)次，將洗液并入容量瓶中，定容備用。三、蒸餾1. 蒸餾器的洗滌蒸氣發(fā)生器中盛有加有數(shù)滴H2SO4的蒸餾水和數(shù)粒沸石。加熱后，產(chǎn)生的蒸汽經(jīng)貯液管、反應(yīng)室至冷凝管，冷凝液體流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗滌10分鐘左右（此時(shí)可用一小燒杯承接冷凝水）。將一只盛有5mL 2硼酸液和1 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，繼續(xù)蒸餾1 2分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器

6、已洗凈。2. 消化樣品及空白的蒸餾取50mL 錐形瓶數(shù)個(gè)，各加25mL 0.01M標(biāo)準(zhǔn)HCl和1 2滴指示劑，用表面皿覆蓋備用。取2mL 稀釋消化液，由小漏斗加入反應(yīng)室。將一個(gè)裝有0.01M標(biāo)準(zhǔn)HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸沒在液體內(nèi)。用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，讓NaOH溶液緩慢流入反應(yīng)室。尚未完全盡時(shí)，加緊夾子，向小漏斗加入約5mL蒸餾水，同樣緩緩放入反應(yīng)室，并留少量水在漏斗內(nèi)作水封。加熱水蒸氣發(fā)生器，沸騰后，關(guān)閉收集器活塞。使蒸汽沖入蒸餾瓶?jī)?nèi)，反應(yīng)生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸餾完全，移動(dòng)錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量蒸餾水

7、冷凝管口。取下錐形瓶，以0.01M NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。記下所耗去的體積。3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌蒸餾完畢后，移取熱源，夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管，此時(shí)由于收集器溫度突然下降，即可將反應(yīng)室殘液吸至收集器。· 標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定在蒸餾樣品及空白前，為了練習(xí)蒸餾和滴定操作，可用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨試做實(shí)驗(yàn)2 3次。標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL，每次實(shí)驗(yàn)取2.0mL。四、計(jì)算樣品的含氮量（mg/mL）=若測(cè)定的蛋白質(zhì)含氮部分只是蛋白質(zhì)（如血清），則：樣品中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）式中：A為滴定空白用去的NaOH平均mL數(shù)，B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數(shù)，V為樣品的mL 數(shù)，0.01

8、 NaOH的摩爾濃度，14為氮的原子量，6.25為系數(shù)（蛋白質(zhì)的平均含氮量為16，由凱氏定氮法測(cè)出含氮量，再乘以系數(shù)6.25即為蛋白質(zhì)量），N為樣品的稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)（1）必須仔細(xì)檢查凱氏定氮儀的各個(gè)連接處，保證不漏氣。（2）凱氏定氮儀必須事先反復(fù)清洗，保證潔凈。（3）小心加樣，切勿使樣品沾污口部、頸部。（4）消化時(shí)，須斜放凱氏燒瓶（45o左右）。火力先小后大，避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。（5）蒸餾時(shí)，小心加入消化液。加樣時(shí)最好將火力擰小或撤去。蒸餾時(shí)，切記火力不穩(wěn)，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。（6）蒸餾后應(yīng)及時(shí)清洗定氮儀。植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)法)考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定

9、蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊馕赵?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0100g/ml），蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測(cè)其含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。在研究每一種酶的作用時(shí)，常以比活（酶活力單位mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測(cè)定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是研究酶活的一個(gè)重要項(xiàng)目。常用測(cè)定方法有Lowry法和考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)將分別介紹這兩種方法。【原理】考馬斯亮藍(lán)G-2

10、50測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊馕赵?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0100g/ml），蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。【儀器與用具】分光光度計(jì)，10ml量筒1支；研體；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度試管14支。【試劑

11、】（1）牛血清白蛋白 配成1000g/ml和100g/ml；（2）考馬斯亮藍(lán)G-250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月；（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。【方法】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）0100g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，按表28-1數(shù)據(jù)配制0100g/ml血清白蛋白液各1ml。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2min后，在595nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表28-

12、1配制0100g/ml血清白蛋白液管號(hào)123456100g/ml牛血清蛋白量(ml)蒸餾水量(ml)蛋白質(zhì)含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.000.10（2）01000g/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作另取6支試管，按表28-2數(shù)據(jù)配制01000g/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。與步驟（1）操作相同，繪出01000g/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表28-2配制01000g/ml血清蛋白血液管號(hào)7891011121000g/ml牛血清白蛋白（ml）蒸餾水量(ml)蛋白質(zhì)含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.

13、80.20.81.001.02. 樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定吸取樣品提取液0.1ml（樣品提取見各酶活測(cè)定），放入具塞刻度試管中（設(shè)兩個(gè)重復(fù)管），加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。3. 結(jié)果計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）=式中C查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）；V提取液總體積（ml）；a測(cè)定所取提取液體積（ml）；W取樣量（g）。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）染色法考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)

14、定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由

15、棕黑色變?yōu)樘m色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。考馬斯亮藍(lán)染色法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

16、因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等。試劑與器材一、試劑考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL

17、 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。2待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀釋200倍。三、器材試管1.5×15cm（×6），試管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。操作方法一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表平行操作。試管編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.0

18、60.15mol/LNaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍(lán)試劑（mL）5mL搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色:A595nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。注意事項(xiàng)· 在試劑加入后的520min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。· 測(cè)定中，蛋白染料復(fù)

19、合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。蛋白質(zhì)的定量測(cè)定紫外（UV）吸收測(cè)定法蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量

20、測(cè)定。紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。此法的缺點(diǎn)是：（1）對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測(cè)定蛋白范圍應(yīng)在0.11.0mg /mL。試劑和器材一、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/mL蛋白溶液。2. 待測(cè)蛋白質(zhì)

21、溶液：人血清，使用前稀釋100倍。二、器材試管1.5×15cm（×9），試管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度計(jì)。操作方法一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取8支試管編號(hào)，按下表分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（mL）00.51.01.52.02.53.04.0蒸餾水（mL）4.03.53.02.52.01.51.00蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)00.1250.2500

22、.3750.5000.6250.7501.00A280二、樣品測(cè)定取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL，搖勻，按上述方法在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。注意事項(xiàng)由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時(shí)也會(huì)影響紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)的定量測(cè)定福林酚法(Folin酚試劑法)Folin酚試劑法最早是由Lowry確定的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本方法。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同

23、的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。Folin酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。實(shí)驗(yàn)原理Folin酚試劑法最早是由Lowry確定的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本方法。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，要嚴(yán)格控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如CO-NH2,-CH2-

24、NH2, CS-NH2以及Tris緩沖液、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物均可干擾Folin酚反應(yīng)，而且對(duì)后者的影響還要大得多。此外，酚類、檸檬酸對(duì)此反應(yīng)也有干擾作用。Folin酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍(lán)色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測(cè)定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可測(cè)定范圍是25250g蛋白質(zhì)。試劑和器材一、試劑Folin酚試劑:試劑甲：4%碳酸鈉溶液；0.2mol

25、/L氫氧化鈉溶液；1%硫酸銅溶液；2%酒石酸鉀鈉溶液。臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。試劑乙：稱鎢酸鈉（Na2WO2?2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除

26、去多余的溴。冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾即成Folin酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。若此貯存液使用過(guò)久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅紫紅紫灰墨綠時(shí)即為滴定終點(diǎn)。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度應(yīng)用。二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成150g/mL蛋白溶液2. 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液人血清，使用前

27、稀釋150倍。三、器材試管1.5×15cm（×6），試管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。操作方法一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表平行操作：試管編號(hào)試劑處理1234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（mL）00.10.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.90.80.60.40.20Folin-酚甲試劑（mL）5.05.05.05.05.05.05.0搖勻，于2025放置10minFolin-酚乙試劑（mL）0.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，30（或室溫2025）水浴保溫30m

28、in，以蒸餾水為空白，在640nm處比色A640繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A640值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定取2支試管，按下表平行操作：試管編號(hào)試劑處理空白管×2樣品管×2血清稀釋液 (mL)00.2蒸餾水 (mL)1.00.8Folin酚甲試劑(mL)5.05.0搖勻，于2025放置10minFolin酚乙試劑(mL)0.50.5迅速搖勻，30（或室溫2025）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在640nm處比色A640三、計(jì)算注意事項(xiàng)(1) Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而Folin酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白

29、質(zhì)作用生成堿性的銅蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)Folin酚乙試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前。(2) 血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，若超過(guò)此范圍則需將血清酌情稀釋。蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定雙縮脲法（Biuret法）具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物。而蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無(wú)關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于110mg /mL。雙縮脲法常

30、用于蛋白質(zhì)的快速測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物。而蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無(wú)關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于110mg /mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測(cè)定。紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：試劑和器材一、試劑雙縮脲試劑：取1.5g硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 · 4H2O）溶于500mL蒸餾水中，在攪拌下加入300mL 10

31、%NaOH溶液，用水稀釋至1000mL。此試劑可長(zhǎng)期保存、備用。二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：10mg/mL結(jié)晶牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：人血清（稀釋10倍）。測(cè)試其他蛋白質(zhì)樣品應(yīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。三、器材試管1.5×15cm（×16），試管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計(jì)。操作方法一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取12支試管分成兩組，按下表平行操作：

32、012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白液(mL)00.20.40.60.81.0蛋白濃度(mg/mL)02.04.06.08.010.0蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑(mL)4.04.04.04.04.04.0充分混勻后，室溫下（2025）放置30minA540取兩組測(cè)定的A540值的平均值，即A540為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、樣品測(cè)定取4支試管分成兩組，按下表平行操作：01血清稀釋液 (mL)00.5蒸餾水 (mL)1.00.5雙縮脲試劑 (mL)4.04.0充分混勻后，室溫下（2025）放置30minA540三、計(jì)算取兩組測(cè)定的平均值計(jì)算：血清樣品蛋白質(zhì)含

33、量（mg/100mL）=其中,Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度（mg/mL），N為稀釋倍數(shù)，V為血清樣品所取的體積（mL），c為樣品原濃度（mg/mL）。注意事項(xiàng)（1）須于顯色后30min內(nèi)比色測(cè)定。各管由顯色到比色的時(shí)間應(yīng)盡可能一致。（3）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測(cè)定。紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量1.280nm的光吸收法 2.280nm和260nm的吸收差法 3.215nm與225nm的吸收差法 4.肽鍵測(cè)定法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性

34、質(zhì)。吸收高峰在280nm 處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該

35、法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。1. 280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外

36、吸收法。測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（A11cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A11cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為 1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)11cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度

37、 = (A280´10 )/ A11cm,280nm (mg/ml)(Q 1%濃度»10mg/ml)2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm 處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 » 1.8純核酸的光吸收比值： A280/A260 » 0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280 和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度=1.45×A2800.74×A260 (mg/ml) 此經(jīng)驗(yàn)公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混