?ICS11.040.30

CCSC30

中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

YY/T1849—2022

重組膠原蛋白

Recombinantcollagenprotein

2022-01-13發(fā)布

2022-08-01實(shí)施

國家藥品監(jiān)督管理局 發(fā)布

YY/T1849—2022

目次

tuW I

i 翻 i

2規(guī)范性引用文件 1

3術(shù)語和定義 1

4質(zhì)量控制 2

4.1il則 2

4.2制備工藝的質(zhì)量控制 2

4.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制 2

5檢測(cè)項(xiàng)目、要求和檢測(cè)方法 2

5.1il則 2

5.2理化項(xiàng)目 3

5.3鑒別 4

5.4會(huì)屯? 4

5.5雜質(zhì)、污染物和添加劑 5

5.6tfi 6

5.7結(jié)構(gòu)表征 6

5.8生物學(xué)功能 7

5.9安全性試驗(yàn) 8

6錄性 9

7生物學(xué)評(píng)價(jià) 9

8包裝、運(yùn)輸和貯存 9

附錄A（資料性）重組膠原蛋白特性分析 10

附錄B（規(guī)范性）細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法 12

附錄C（規(guī)范性）細(xì)胞移行試驗(yàn)——細(xì)胞劃痕法 14

參考t獻(xiàn) 15

YY/T1849—2022

本文件按照GB/T1.1—2020（（標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。

本文件由中國食品藥品檢定研究院歸口。

本文件起草單位：中國食品藥品檢定研究院、四川省藥品檢驗(yàn)研究院（四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心）、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院、北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)療器械檢驗(yàn)中心、陜西巨子生物技術(shù)有限公司、山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司、江蘇創(chuàng)健醫(yī)療科技有限公司、江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司。

本文件主要起草人：陳亮、劉興蘭、侯麗、韓建民、徐麗明、段志廣、李海航、王建、趙健烽、趙代國、王鸞鸞、王覺曉、范行良、吳洋、蔣若丹、蘭婉玲、蓋瀟瀟、嚴(yán)建亞、孫丹丹、田旭棟、黃建民。

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YY/T1849—2022

重組膠原蛋白

1范圍

本文件規(guī)定了重組膠原蛋白的質(zhì)量控制要求、檢測(cè)指標(biāo)及其檢測(cè)方法等。

本文件適用于作為醫(yī)療器械原材料的重組膠原蛋白的質(zhì)量控制。

注：鑒于目前的技術(shù)研發(fā)現(xiàn)狀，本文件中的重組膠原蛋白主要指基于人的膠原蛋白基因重組的產(chǎn)物?；诜侨四z原蛋白基因的重組膠原蛋白或類膠原蛋白產(chǎn)物可參考本文件，但需要根據(jù)具體的產(chǎn)品特性和生產(chǎn)工藝進(jìn)行質(zhì)控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)

GB/T16886.20醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法

GB18278.1要求

GB18279.1制的要求

GB18280.1要求

YY/T1453

醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌

醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌

醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌

濕熱第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制

環(huán)氧乙烷第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控

輻射第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制

組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品I型膠原蛋白表征方法

YY/T1465（所有部分）醫(yī)療器械免疫原性評(píng)價(jià)方法

YY/T1805.2組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第2部分：I型膠原蛋白分子量檢測(cè)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法

YY/T1805.3組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白含量檢測(cè)液相色譜-質(zhì)譜法

中華人民共和國藥典

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

膠原蛋白 collagen

膠原

一類含有至少20種在遺傳學(xué)上不同類型的分泌蛋白質(zhì)家族，主要擔(dān)任機(jī)體的結(jié)構(gòu)支撐功能，具有獨(dú)特的由三條多肽鏈（被稱為a鏈）組成的三螺旋構(gòu)型，并具有一定的生物學(xué)功能。

3.2

重組膠原蛋白recombinantcollagenprotein

采用重組DNA技術(shù)，對(duì)編碼所需人膠原蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行遺傳操作和（或）修飾，利用質(zhì)?；虿《据d體將目的基因帶人適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞（細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞等）中，表達(dá)并翻譯成膠原蛋白（3.1）或類似膠原蛋白（3.1）的多肽，經(jīng)過提取和純化等步驟制備而成。

4質(zhì)量控制

4.1通則

由于重組基因片段的型別與序列的不同，表達(dá)體系的差異，致使獲得的產(chǎn)物不盡相同，與天然膠原蛋白相比，氨基酸組成、分子量大小和（或）結(jié)構(gòu)可能差異很大，甚至是個(gè)全新的蛋白質(zhì)。因此，宜對(duì)其進(jìn)行全面的特性分析（見附錄A），進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

重組膠原蛋白的質(zhì)量控制與分子量大小、結(jié)構(gòu)特性、質(zhì)量屬性復(fù)雜程度以及生產(chǎn)工藝相關(guān)。質(zhì)量控制體系主要包括原輔料質(zhì)量控制、生產(chǎn)工藝和過程控制及最終成品的檢測(cè)等。應(yīng)通過成品檢測(cè)、過程控制和工藝驗(yàn)證相結(jié)合的方法，確保各類雜質(zhì)已去除或降低至可接受水平。

4.2制備工藝的質(zhì)量控制

重組膠原蛋白屬于一種重組蛋白，應(yīng)參照《中華人民共和國藥典》“人用重組DNA蛋白制品總論”中“制造”的所有要求，包括：基本要求、工程細(xì)胞（細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞等）的控制（表達(dá)載體和宿主細(xì)胞、細(xì)胞庫系統(tǒng)、細(xì)胞庫的質(zhì)量控制、細(xì)胞基質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性）、生產(chǎn)過程的控制（細(xì)胞培養(yǎng)、提取和純化、原液、半成品和成品）和生產(chǎn)工藝變更要求，建立質(zhì)量控制體系。不適用條款或事項(xiàng)需給出合理的說明。

4.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制

重組膠原蛋白成品的質(zhì)量控制包括采用參比品和經(jīng)驗(yàn)證的方法評(píng)估已知和（或）潛在的成品相關(guān)物質(zhì)和工藝相關(guān)物質(zhì)，以及采用適宜的方法對(duì)成品鑒別、生物學(xué)功能、純度和雜質(zhì)等進(jìn)行檢測(cè)和分析。

選擇已證明足夠穩(wěn)定且適合臨床試驗(yàn)的一個(gè)（多個(gè)）批次，或用一個(gè)代表批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學(xué)功能等各種分析。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，應(yīng)對(duì)參比品做全面深人的表征/特性分析。參比品的建立和制備應(yīng)參照《中華人民共和國藥典》“生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定”的相關(guān)要求。

用于理化測(cè)定等方面的參比品，如用于肽圖或等電點(diǎn)測(cè)定的參比品，可用原液直接分裝制備，一般-70°C以下或經(jīng)驗(yàn)證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，參比品應(yīng)進(jìn)行必要的分析鑒定，包括：蛋白質(zhì)含量、等電點(diǎn)、純度、N端氨基酸序列、分子量、肽圖、指紋肽圖譜庫、二硫鍵分析及糖基分析（酵母或其他真核細(xì)胞表達(dá)）等。

5檢測(cè)項(xiàng)目、要求和檢測(cè)方法

5.1通則

收獲液經(jīng)提取、純化分裝于中間貯存容器中即為原液。原液的檢驗(yàn)項(xiàng)目取決于工藝的驗(yàn)證、一致性的確認(rèn)和預(yù)期成品相關(guān)雜質(zhì)與工藝相關(guān)雜質(zhì)的水平。應(yīng)采取適當(dāng)方法對(duì)原液質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)應(yīng)與參比品進(jìn)行比較。經(jīng)工藝驗(yàn)證后，可由一批或多批原液合并生產(chǎn)半成品，制成成品前，如需對(duì)原液進(jìn)行稀釋或加人其他輔料制成半成品，應(yīng)確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢測(cè)項(xiàng)目和可接受標(biāo)準(zhǔn)。

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YY/T1849—2022

根據(jù)具體重組膠原蛋白成品的特性確定需要進(jìn)行的特性分析檢測(cè)項(xiàng)目。建立或驗(yàn)證重組膠原蛋白生產(chǎn)過程的有效性或可接受性的特性分析檢測(cè)項(xiàng)目可不納人常規(guī)質(zhì)量控制中，但應(yīng)對(duì)某一特定質(zhì)量屬性是否放人常規(guī)放行標(biāo)準(zhǔn)予以說明。常規(guī)質(zhì)量控制的檢測(cè)項(xiàng)目包括如下幾個(gè)方面。

5.2理化項(xiàng)目

5.2.1外觀（如性狀、顏色）

肉眼直接觀測(cè)，供試品應(yīng)為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

5.2.2可見異物

適用時(shí)，按照《中華人民共和國藥典》“可見異物檢查法”的“燈檢法”進(jìn)行檢測(cè)，供試品應(yīng)無明顯異物。

5.2.3溶解性

應(yīng)根據(jù)供試品的溶解特性，對(duì)供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進(jìn)行表征和闡述。

5.2.4水分

取供試品約1g?2g，按照《中華人民共和國藥典》“水分測(cè)定法”第二法（烘干法）測(cè)定，或取供試品約10mg按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測(cè)定，升溫程序：從室溫以10°C/min速率升溫至105°C.保持60min。減失重量應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測(cè)定法。

5.2.5熾灼殘?jiān)?/p>

按照《中華人民共和國藥典》“熾灼殘?jiān)鼨z查法”測(cè)定，供試品應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。

5.2.6pH值

用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液，若使用其他溶劑溶解應(yīng)明確說明使用溶劑及濃度，按照《中華人民共和國藥典》“pH值測(cè)定法”測(cè)定，應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。

5.2.7滲透壓摩爾濃度

如適用，用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液或根據(jù)臨床預(yù)期使用，將供試品配制成相應(yīng)溶液，按照《中華人民共和國藥典》“滲透壓摩爾濃度測(cè)定法”測(cè)定，應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。5.2.8動(dòng)力黏度

取供試品按照《中華人民共和國藥典》“黏度測(cè)定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定法”測(cè)定，需要詳細(xì)描述試驗(yàn)條件，動(dòng)力黏度值應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。

注：對(duì)于重組膠原蛋白凝膠，宜測(cè)定動(dòng)力黏度。

5.2.9熱穩(wěn)定性

采用差示掃描量熱法（DSC）進(jìn)行解聚溫度分析。按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”進(jìn)行。初始溫度20H2°C/mm速度升溫至200°C.記錄熱分析曲線。根據(jù)供試品的通常貯存性狀（如凍干粉等）和預(yù)期使用性狀進(jìn)行相同或相似樣品條件下的差示掃描量熱分析。

注：水不溶性重組膠原蛋白的熱穩(wěn)定性測(cè)定宜采用差示掃描量熱法（DSC）進(jìn)行。

將供試品原液，或重組膠原蛋白凍干粉或海綿加水制成10mg/mL的溶液，置（57士0.5）°C水

浴中保溫4h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察應(yīng)無凝膠化或絮狀物。

5.2.10裝量及其差異

按照《中華人民共和國藥典》“最低裝量檢查法”，根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。

5.3鑒別

5.3.1肽圖

按照《中華人民共和國藥典》“肽圖檢查法”的第一法“胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法”進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)與參比品肽圖一致，主要特征肽段相對(duì)比例（響應(yīng)強(qiáng)度）應(yīng)與參比品基本一致。

注：如胰蛋白酶不能水解，選擇適宜的其他蛋白酶。

按照《中華人民共和國藥典》“質(zhì)譜法”進(jìn)行測(cè)定，采用適宜的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)各色譜峰對(duì)應(yīng)的肽段進(jìn)行定性，序列覆蓋率應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。

注：如胰蛋白酶不能水解，選擇適宜的其他蛋白酶。

5.3.2末端氨基酸序列

用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果應(yīng)符合理論預(yù)測(cè)（每年應(yīng)至少做一次）。

5.3.3分子量

按照YY/T1805.2規(guī)定的方法條件進(jìn)行試驗(yàn)，分子量應(yīng)符合標(biāo)示要求。

按照《中華人民共和國藥典》“高效液相色譜法”進(jìn)行分子量分析時(shí)，出峰保留時(shí)間應(yīng)與定性參比品（經(jīng)過飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定過的重組膠原蛋白）保持一致。

按照《中華人民共和國藥典》“質(zhì)譜法”進(jìn)行測(cè)定，其分子量應(yīng)與理論分子量一致。

5.3.4等電點(diǎn)

按照《中華人民共和國藥典》“電泳法”的“等電聚焦電泳法”或“毛細(xì)管電泳法”測(cè)定，其等電點(diǎn)應(yīng)在標(biāo)示范圍內(nèi)。

5.4純度

5.4.1電泳法

按照《中華人民共和國藥典》“電泳法”的非還原型“SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳法”測(cè)定，分離膠的膠濃度為15%，供試品加水制成濃度為1mg/mL?2mg/mL的溶液，點(diǎn)樣量10ML，考馬斯亮藍(lán)R250染色，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)符合標(biāo)示要求。

5.4.2高效液相色譜法

按照《中華人民共和國藥典》“色譜法”的“分子排阻色譜法”測(cè)定，按面積歸一化法計(jì)算純度，其結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)示要求。

注1：適用時(shí)，可采用反相高效液相色譜法。

注2:適用時(shí)，可采用樣品圖譜與參比品一致，或主峰保留時(shí)間與參比品主峰保留時(shí)間一致進(jìn)行判斷。

5.5雜質(zhì)、污染物和添加劑

5.5.1總則

按照《中華人民共和國藥典》“人用重組DNA蛋白制品總論”對(duì)“純度和雜質(zhì)”的要求，工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制（如蛋白質(zhì)A、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、其他潛在的培養(yǎng)或純化殘留物等）通常在原液階段進(jìn)行。如經(jīng)充分驗(yàn)證證明生產(chǎn)工藝對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除已達(dá)到高水平時(shí)，工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制可在恰當(dāng)工藝步驟的中間產(chǎn)物進(jìn)行，可不列人放行檢測(cè)中。雜質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目可能涉及，但不限于如下項(xiàng)目。

5.5.2外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“外源性DNA殘留量測(cè)定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定/‘熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿足70%?130%;“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿足50%?150%，應(yīng)規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測(cè)限，則應(yīng)采用“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定。

注1：宜根據(jù)預(yù)期臨床用途（作為植入物體內(nèi)使用，還是作為敷料等體表、黏膜使用）、使用量等，確定含重組膠原蛋白的產(chǎn)品臨床最大使用M的外源性DNA殘留M限值。如果含重組膠原蛋白的產(chǎn)品預(yù)期為體內(nèi)植人劑，推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險(xiǎn)程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。

注2:生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達(dá)的基因工程重組產(chǎn)品外源性DNA殘留量，如：注射用人生長激素＜1.5ng/mg,或注射用人干擾素＜10ng/劑；CHC）細(xì)胞表達(dá)的基因工程重組產(chǎn)品（如人促紅素）外源性DNA殘留量＜100pg/劑（10000IU）;重組乙型肝炎疫苗（CHO細(xì)胞）＜10pg/劑。

5.5.3大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植人），或0.1%以下（外用）。

5.5.4酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植人），或0.1%以下（外用）。

5.5.5CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植人），或0.1%以下（外用）。

5.5.6殘余抗生素含量/活性

應(yīng)根據(jù)工藝中采用的表達(dá)體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法測(cè)定殘余抗生素含量/活性，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析規(guī)定可接受的限量要求。不應(yīng)有殘余抗生素活性。

殘余抗生素活性按照《中華人民共和國藥典》“抗生素殘留量檢查法（培養(yǎng)法）”進(jìn)行試驗(yàn)。

殘余抗生素含量可按照《中華人民共和國藥典》“免疫化學(xué)法”的“酶聯(lián)免疫吸附法”進(jìn)行試驗(yàn)。其中，氨芐西林殘留量也可采用高效液相色譜-質(zhì)譜法。推薦液相色譜條件可采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A為水（甲酸0.1%），流動(dòng)相B為乙腈（甲酸0.1%）梯度洗脫；質(zhì)譜采用電噴霧電離離子源（ESI）為離子源。

注：根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析規(guī)定可接受的限M要求。如疫苗抗生素殘留規(guī)定＜50ng/劑。

5.5.7促炎性污染物（肽聚糖等）

采用經(jīng)驗(yàn)證的方法或經(jīng)驗(yàn)證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒（ELISA）檢測(cè)殘留肽聚糖，應(yīng)根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)定可接受的限量要求。

5.5.8重金屬及微量元素含量

對(duì)工藝中添加的重金屬元素，應(yīng)按照《中華人民共和國藥典》“原子吸收分光光度法”，或“電感耦合等離子體質(zhì)譜法”進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)示的限量要求。

殘留重金屬總量按照《中華人民共和國藥典》“重金屬檢查法”檢測(cè)，重金屬總量（以Pb計(jì)）應(yīng)＜10（ig/g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

殘留金屬元素按照《中華人民共和國藥典》“原子吸收分光光度法”“電感耦合等離子體質(zhì)譜法”或相當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測(cè)定（應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)和驗(yàn)證），其結(jié)果應(yīng)符合限量要求：砷（As）＜l/2g/g，采（Hg）=C4（Ltg/g.鉛（Pb）sCl5fig/g，絡(luò)（Cr）、鎘（Cd）5C50/ig/g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。預(yù)期植人用的重組膠原蛋白成品中銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）均＜50Mg/g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

5.5.9添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護(hù)劑等添加劑，應(yīng)給出其限量要求和檢測(cè)方法。

5.6含量

5.6.1重組膠原蛋白含量用總蛋白含量和純度計(jì)算?？偟鞍缀康臏y(cè)定按照《中華人民共和國藥典》“蛋白質(zhì)含量測(cè)定法”的“凱氏定氮法”進(jìn)行測(cè)定，純度按5.4進(jìn)行檢測(cè)。含量結(jié)果應(yīng)在標(biāo)示量的90%?110%。

注：關(guān)于凱氏定氮法計(jì)算蛋白含量時(shí)的系數(shù)，需要根據(jù)理論氨基酸序列和異質(zhì)性狀態(tài)的測(cè)算和驗(yàn)證予以確定。

如果是液體或凝膠狀樣品，以重組膠原蛋白含量除以樣品總體積，即可得到相對(duì)于單位體積樣品中重組膠原蛋白的相對(duì)含量數(shù)據(jù)，標(biāo)示為mg/mL；如果為固體樣品或凍干品，以重組膠原蛋白含量除以總質(zhì)量，即可得到單位質(zhì)量樣品中重組膠原蛋白的相對(duì)含量數(shù)據(jù)，標(biāo)示為mg/mg。

5.6.2特征多肽法：用高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行特異性特征多肽的定量檢測(cè)，得到重組膠原蛋白特征多肽含量?；谔禺愋蕴卣鞫嚯牡母咝б合嗌V-質(zhì)譜方法按照YY/T1805.3的規(guī)定進(jìn)行。

5.7結(jié)構(gòu)表征

5.7.1異質(zhì)性分析

如適用，應(yīng)充分表征重組膠原蛋白的各種異質(zhì)性（如脫酰胺化、氧化、異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等）?？墒褂酶叻直媛噬V質(zhì)譜技術(shù)（如：LCMS-QTOF）對(duì)樣品適宜的蛋白質(zhì)酶（如：胰蛋白酶）酶解產(chǎn)物進(jìn)行肽圖指紋圖譜分析，通過將天冬酰胺脫酰胺化和甲硫氨酸氧化修飾設(shè)置為可變修飾，分析多見的脫酰胺化和氧化異質(zhì)性。應(yīng)通過適合的理化方法分析高級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過生物學(xué)功能進(jìn)行確證，也可采用體外或體內(nèi)證實(shí)其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級(jí)結(jié)構(gòu)確證的補(bǔ)充。

5.7.2 —級(jí)結(jié)構(gòu)的表征

應(yīng)采用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法進(jìn)行氨基酸序列分析。其結(jié)果應(yīng)符合理論序列。

5.7.3紅外光譜

每種重組膠原蛋白都有其特征的紅外光譜，供試品的紅外光譜圖應(yīng)與參比品一致。光譜圖應(yīng)規(guī)定

5

YY/T1849—2022非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如：酰胺i、酰胺n、酰胺nr）的特征峰位置。

5.7.4圓二色（CD）光譜

膠原的CD譜圖在195nm附近的波長處有負(fù)峰，在221nm附近的波長處有正峰。如果檢測(cè)不到在221nm附近處的正峰，則提示沒有三螺旋結(jié)構(gòu)。如果定性檢測(cè)證實(shí)供試品中有三螺旋結(jié)構(gòu)，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對(duì)照品和其完全變性的膠原蛋白對(duì)照品混合物作為外標(biāo)法對(duì)照品，與在221nm附近波長處的正峰強(qiáng)度進(jìn)行擬合，實(shí)現(xiàn)三螺旋含量的相對(duì)定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國家醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照品。

5.7.5微量差熱分析（DSC）

膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的特征表現(xiàn)出特定的吸收峰，如組織提取牛I型膠原蛋白在（43+l）°C有吸收峰，如果檢測(cè)不到特征峰則提示供試品中沒有三螺旋結(jié)構(gòu)。如果定性檢測(cè)已證實(shí)供試品含有三螺旋結(jié)構(gòu)，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對(duì)照品和其完全變性的膠原蛋白對(duì)照品混合物作為外標(biāo)法對(duì)照品，對(duì)三螺旋含量進(jìn)行相對(duì)定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國家醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照品。

5.7.6蛋白酶敏感性分析

如適用，可用胰蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶敏感性試驗(yàn)，提示有無三螺旋結(jié)構(gòu)，及檢測(cè)沒有螺旋結(jié)構(gòu)的單鏈含量，間接獲得三螺旋結(jié)構(gòu)的含量比。通過加熱變性處理和非加熱變性處理樣品的蛋白酶酶解產(chǎn)物中特征多肽含量的比較分析，如果二者特征多肽檢測(cè)的響應(yīng)強(qiáng)度（譜峰高度或面積）一致，則提示無三螺旋結(jié)構(gòu)；如果加熱變性處理后樣品的響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于非加熱變性處理樣品，則提示可能含有三螺旋結(jié)構(gòu)。

如果重組膠原蛋白中存在三螺旋結(jié)構(gòu)，應(yīng)選擇2種或2種以上方法進(jìn)行充分的表征和確證。推薦使用組織提取膠原蛋白對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比分析。

5.7.7脯氨酸羥基化分析

如適用，應(yīng)進(jìn)行脯氨酸羥基化分析，按照YY/T1453規(guī)定的方法，使用氨基酸分析儀定量檢測(cè)羥脯氨酸含量，其結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)示值。

5.7.8糖譜/糖基化修飾分析

如適用，應(yīng)進(jìn)行糖譜/糖基化修飾分析，參照《中華人民共和國藥典》“單抗N糖譜測(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定，供試品測(cè)定結(jié)果應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。必要時(shí)應(yīng)將供試品與參比品進(jìn)行比較。

5.8生物學(xué)功能

5.8.1通則

重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對(duì)聲稱的生物學(xué)功能宜進(jìn)行定性/定量分析。

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。重組膠原蛋白的主要生物學(xué)功能是為細(xì)胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖生長、分化等。因此，可通過評(píng)價(jià)細(xì)胞-膠原蛋白相互作用來評(píng)價(jià)重組膠原蛋白的生物學(xué)功能。

注1：在生物學(xué)性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，如果重組膠原蛋白是溶于酸性溶液中形成pH值呈酸性的黏稠狀液體，需對(duì)其可溶性和pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，在不影響重組膠原蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的前提下，采用適宜的方式制備供試樣品。注2:如果產(chǎn)品以非無菌的方式提供，可將樣品除菌后用于細(xì)胞試驗(yàn)，宜考慮除菌方式對(duì)重組膠原蛋白生物學(xué)功能的影響。

7

YY/T1849—2022

5.8.2細(xì)胞增殖

用重組膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法，采用合適的預(yù)期臨床應(yīng)用時(shí)可能接觸的細(xì)胞（如皮膚成纖維細(xì)胞），接種密度在50%左右，常規(guī)培養(yǎng)2天?3天后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，考察重組膠原蛋白包被梯度濃度的劑量-效應(yīng)關(guān)系。具體檢測(cè)方法可采用MTT法、CCK8法等進(jìn)行檢測(cè)（按照試劑盒的操作說明進(jìn)行），采用無重組膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，分析細(xì)胞增殖率。

如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的促細(xì)胞增殖作用。

5.8.3細(xì)胞分化

用重組膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法，采用合適的預(yù)期臨床應(yīng)用時(shí)可能接觸的細(xì)胞（如皮膚成纖維細(xì)胞），接種密度在90%左右，常規(guī)培養(yǎng)3天?7天后檢測(cè)細(xì)胞分化情況。具體方法可采用RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞的分化標(biāo)志物（如：a-SMA、Vimentin、Fibroblastsurfaceantigen）,采用無重組膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，分析細(xì)胞分化情況。

如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的促細(xì)胞分化作用。

5.8.4細(xì)胞黏附性

細(xì)胞貼壁情況可通過細(xì)胞貼壁率試驗(yàn)簡(jiǎn)單地評(píng)價(jià)細(xì)胞黏附性。但是，細(xì)胞黏附性還包括細(xì)胞黏附強(qiáng)度（相對(duì)細(xì)胞黏附百分比），按照附錄B或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行。

如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的細(xì)胞黏附作用。

5.8.5細(xì)胞的遷移或移行

重組膠原蛋白用于組織修復(fù)與重建時(shí)，應(yīng)有利于細(xì)胞的識(shí)別、移行，細(xì)胞移行試驗(yàn)按照附錄C或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行。

如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的細(xì)胞的識(shí)別、移行作用。

5.9安全性試驗(yàn)

5.9.1概述

應(yīng)根據(jù)所采用的表達(dá)體系（細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞等）而定，檢測(cè)指標(biāo)包括，但不限于如下幾項(xiàng)。注：在生物學(xué)性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，如果重組膠原蛋白是溶于酸性溶液中形成pH值呈酸性的黏稠狀液體，需對(duì)其可溶性和pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，在不影響重組膠原蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的前提下，采用適宜的方式制備供試樣品。

5.9.2無菌

如果重組膠原蛋白成品以無菌的方式提供，則應(yīng)按照GB18278.1,GB18279.1.GB18280.1對(duì)滅菌過程進(jìn)行確認(rèn)和常規(guī)控制。按照《中華人民共和國藥典》“無菌檢查法”進(jìn)行無菌檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)無菌。

5.9.3細(xì)菌內(nèi)毒素

按照《中華人民共和國藥典》“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定的方法測(cè)定，應(yīng)符合標(biāo)示的規(guī)定限值。注1：醫(yī)療器械產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量要求與其與人體的接觸方式等因素有關(guān)，宜考慮這些因素來規(guī)定作為原材料的重組膠原蛋白的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。

注2:《中華人民共和國藥典》規(guī)定，對(duì)注射劑，人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑M為5EU。

5.9.4微生物限度

如果重組膠原蛋白成品以非無菌的方式提供，每1g、lmL或10cm2供試品中需氧菌總數(shù)不得超過102CFU，霉菌和酵母菌菌落數(shù)不得超過10CFU，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

檢測(cè)方法：用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液制備供試品溶液。按照《中華人民共和國藥典》“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)。

6穩(wěn)定性

重組膠原蛋白穩(wěn)定性受多種因素影響，包括純化工藝、微生物負(fù)載、包裝貯存條件等。重組膠原蛋白的穩(wěn)定性變化，如降解，可能會(huì)直接影響預(yù)期用于醫(yī)療器械產(chǎn)品的安全性和有效性，因此，應(yīng)對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)和分析。

與穩(wěn)定性相關(guān)的工藝驗(yàn)證宜采用連續(xù)三批次重組膠原蛋白進(jìn)行。在相關(guān)工藝條件無變化時(shí)，每年宜進(jìn)行至少一個(gè)批次產(chǎn)品的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。在工藝條件有變化吋，應(yīng)考慮對(duì)重組膠原蛋白穩(wěn)定性的影響，必要時(shí)進(jìn)行再次驗(yàn)證。

7生物學(xué)評(píng)價(jià)

作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，應(yīng)按照GB/T16886.1的要求對(duì)重組膠原蛋白進(jìn)行相應(yīng)必要的生物學(xué)評(píng)價(jià)。

基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可能引起人體預(yù)測(cè)不到的免疫原性，特別是長期反復(fù)使用時(shí)。因此，如果不能排除免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，則宜增加免疫學(xué)研究。試驗(yàn)方法應(yīng)按照GB/T16886.20及YY/T1465系列標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行。

如果產(chǎn)品以非無菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，宜考慮滅菌方式及滅菌對(duì)重組膠原蛋白的影響。

注：在生物學(xué)性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，如果重組膠原蛋白是溶于酸性溶液中形成pH值呈酸性的黏稠狀液體，需對(duì)其可溶性和pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，在不影響重組膠原蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的前提下，采用適宜的方式制備供試樣品。

8包裝、運(yùn)輸和貯存

8.1若生產(chǎn)商作為本單位研發(fā)醫(yī)療器械產(chǎn)品的初始材料（原材料）時(shí)，應(yīng)按照醫(yī)療器械生產(chǎn)中對(duì)原材料管理的質(zhì)量體系進(jìn)行包裝、貯存、運(yùn)輸相關(guān)管理。

8.2若生產(chǎn)商作為醫(yī)療器械研發(fā)的原材料銷售時(shí)，應(yīng)提供必要的信息，在品名和來源的信息中應(yīng)至少包括：表達(dá)體系、DNA模板種屬及其膠原蛋白類型、氨基酸長度和編輯情況，如：（aaX—aa￥）?（重復(fù)次數(shù)），并建議考慮相關(guān)醫(yī)療器械產(chǎn)品對(duì)原材料包裝、貯存、運(yùn)輸?shù)囊蟆?/p>

附錄A

（資料性）

重組膠原蛋白特性分析

A.1概述

研發(fā)階段對(duì)重組膠原蛋白的理化特性、生物學(xué)功能/作用、免疫學(xué)特性、純度和雜質(zhì)等進(jìn)行嚴(yán)格的特性分析鑒定是建立并確定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。需采用廣泛的分析技術(shù)來表征其理化性質(zhì)（如：分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、疏水性等），以及對(duì)糖基化等各種翻譯后修飾進(jìn)行充分鑒定，并納人適當(dāng)?shù)臋z測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有預(yù)期的構(gòu)象、聚集和（或）降解狀態(tài)及其高級(jí)結(jié)構(gòu)。

A.2理化特性

A.2.1 —級(jí)結(jié)構(gòu)

包括二硫鍵（氫鍵）連接方式的氨基酸序列。宜測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。

注：可能需要采用綜合的方法來測(cè)定氨基酸序列。

氨基酸序列測(cè)定還宜考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來源的制品），信號(hào)肽或前導(dǎo)序列和其他可能的N端、C端修飾（如乙?；?、酰胺化或者由于外源酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如脫酰胺化、氧化、異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等）。

A.2.2糖基化修飾

如有（如酵母菌發(fā)酵工藝或其他真核細(xì)胞表達(dá)體系制備的產(chǎn)品），則宜對(duì)糖基化修飾進(jìn)行全面的分析和確定，如糖基化修飾與產(chǎn)品半衰期和生物學(xué)作用相關(guān)，則宜確定糖的含量（如中性糖、氨基糖和唾液酸）。糖型結(jié)構(gòu)可能與不良反應(yīng)相關(guān)（如非人類的糖型結(jié)構(gòu)或其殘基），宜盡可能對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)、糖型以及多肽鏈的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行深人分析。必要時(shí)應(yīng)進(jìn)一步就電荷異質(zhì)性進(jìn)行檢測(cè)分析。

A.2.3局級(jí)結(jié)構(gòu)

如有，則宜通過適合的理化方法分析髙級(jí)結(jié)構(gòu)，并且通過生物學(xué)功能或作用來確認(rèn)。生物學(xué)功能或作用是對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的確證，也可采用體外或體內(nèi)證實(shí)其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級(jí)結(jié)構(gòu)確證的補(bǔ)充。

A.3純度、雜質(zhì)和污染物

A.3.1概述：重組膠原蛋白的雜質(zhì)主要包括自身相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物。宜盡可能地對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，并采用適宜的方法評(píng)價(jià)其對(duì)生物學(xué)功能的影響。

A.3.2自身相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)：主要源于重組膠原蛋白的異質(zhì)性和降解產(chǎn)物。需要對(duì)目標(biāo)重組膠原蛋白的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時(shí)可不做雜質(zhì)考慮。但宜考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間產(chǎn)品降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。

A.3.3工藝相關(guān)雜質(zhì)：包括來源于生產(chǎn)工藝本身，如細(xì)胞基質(zhì)來源、細(xì)胞培養(yǎng)來源和下游工藝。宜對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA、細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進(jìn)行鑒別、評(píng)估，并進(jìn)行定性和/或定量分析。

A.3.4污染物：指所有引人的，且并非生產(chǎn)過程所需的物質(zhì)（如各種微生物、細(xì)菌內(nèi)毒素）。此外，還宜考慮采用其他適宜檢測(cè)方法對(duì)可能污染的包括肽聚糖等在內(nèi)的非細(xì)菌內(nèi)毒素促炎性污染物進(jìn)行控制。

A.4生物學(xué)功能

評(píng)價(jià)重組膠原蛋白實(shí)現(xiàn)預(yù)期的生物學(xué)功能的特定能力、潛力，如膠原蛋白-細(xì)胞相互作用。同時(shí)也宜關(guān)注可能引起的負(fù)效應(yīng)。

基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，作為一種完整的蛋白質(zhì)物質(zhì)屬于非人體內(nèi)存在的全新蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行詳盡的結(jié)構(gòu)分析和生物學(xué)功能（正向、負(fù)向）分析。

A.5免疫化學(xué)特性

天然膠原蛋白有一定的糖基化，酵母發(fā)酵技術(shù)制備的膠原蛋白產(chǎn)物可能有輕度的糖基化。糖基化可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)功能和免疫原性，宜進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶匦匝芯?。必要時(shí)宜對(duì)目標(biāo)分子中與相應(yīng)表位作用的部分進(jìn)行分析確證，包括對(duì)這些結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)鑒別（如蛋白質(zhì)、低聚糖、糖蛋白、糖脂）和相關(guān)適合的特征研究（如氨基酸序列和糖型）。

基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不僅可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)功能，也可能引起預(yù)測(cè)不到的免疫原性，特別是長期反復(fù)使用時(shí)，因此，宜進(jìn)行免疫化學(xué)特性分析和充分的免疫原性評(píng)價(jià)。

A.6含量

膠原蛋白含量以質(zhì)量/質(zhì)量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）或質(zhì)量/體積（質(zhì)量濃度）表示。進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)時(shí)宜除外宿主蛋白質(zhì)殘留等雜蛋白。可通過高效液相色譜法（HPLC）或絕對(duì)定量的方法，如：利用合成的能夠代表擬測(cè)定的重組膠原蛋白產(chǎn)物的特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)進(jìn)行膠原蛋白含量測(cè)定，并可用于鑒別、溯源和驗(yàn)證。

A.7參比品

宜選擇已證明足夠穩(wěn)定或用一個(gè)代表性批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學(xué)活性等各種分析，并按特性分析要求進(jìn)行全面分析鑒定。

用于理化測(cè)定等方面的對(duì)照品，如用于肽圖或等電點(diǎn)測(cè)定的對(duì)照品，可用原液直接分裝制備，一般-70°C以下或經(jīng)驗(yàn)證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，對(duì)照品宜進(jìn)行必要的分析鑒定，包括：蛋白質(zhì)含量、比活性、等電點(diǎn)、純度、N端氨基酸序列、質(zhì)譜分子量、液質(zhì)肽圖、指紋肽圖譜庫、二硫鍵分析及糖基分析（酵母或其他真核細(xì)胞表達(dá)）等。

13

附錄B

（規(guī)范性）

細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法

B.1試驗(yàn)原理

為研究材料與細(xì)胞的黏附作用大小，可通過離心法定量測(cè)定膠原蛋白與細(xì)胞形成黏附后分離所需的力。將細(xì)胞懸液在涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一定時(shí)間，用熒光標(biāo)記細(xì)胞，在最佳相對(duì)離心力（RCF）洗脫未黏附的細(xì)胞，測(cè)定離心前后細(xì)胞分離百分比，評(píng)價(jià)待測(cè)重組膠原蛋白樣品的相對(duì)促細(xì)胞黏附性。試驗(yàn)原理示例圖見圖B.1。

離心前細(xì)胞計(jì)數(shù) 離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖B.1細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法試驗(yàn)原理示例圖

B.2器具、試劑及耗材

試驗(yàn)使用的器具、試劑和耗材如下：

a） 試驗(yàn)細(xì)胞：如NIH/3T3細(xì)胞（ATCCCRL-1658小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）；

b） 陰性D-PBS溶液；

c） 對(duì)照材料:膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品；

d） D-PBS溶液、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Hoechst33342熒光染色液.BSA-PBS溶液；

e） 細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔，平底）、封口膜（醋酸密封帶或等效材料）、鋁箔。

B.3試驗(yàn)步驟與方法

B.3.1涂層制備

向96孔板內(nèi)分別加人100標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品、D-PBS空白對(duì)照。每個(gè)樣品包被制備4個(gè)孔，在37°C.5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h?4h。從孔中除去多余的包被溶液，加人100mL1%BSA-PBS溶液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。移除孔內(nèi)液體后，用D-PBS洗滌三次，棄除清洗液，用封口膜密封后置于4°C備用。

注：宜根據(jù)重組膠原蛋白樣品的特性，pH等考察包被條件，確認(rèn)最大包被效率。

B.3.2細(xì)胞制備

將NIH/3T3細(xì)胞于37°C.5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%?90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或細(xì)胞接種。使用已經(jīng)與Hoechst33342熒光染色劑（10%）預(yù)混合的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞稀釋至5X104/mL。將100ML細(xì)胞加人孔中，用鋁箔覆蓋，并在37°C.5%CO2下孵育1h。測(cè)量3個(gè)重復(fù)樣品，第4個(gè)孔用來調(diào)整顯微鏡參數(shù)，不使用其測(cè)量值。

B.3.3檢測(cè)

確定最佳相對(duì)離心力（RCF），使膠原蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)細(xì)胞黏附性比值宜為50%?60%。使用倒置顯微鏡捕獲3個(gè)孔中每個(gè)孔的熒光平鋪圖像。每個(gè)孔用D-PBS填充以形成“反向彎月面”，吹掃氣泡并用封口膜覆蓋。以最佳相對(duì)離心力在22°C下離心（倒置放置）5min。離心后，棄去封口膜，從孔中取出上清液。用D-PBS清洗1次后，加人100D-PBS0對(duì)于3個(gè)孔中的每個(gè)孔進(jìn)行拍攝。計(jì)算每個(gè)樣品大約2400個(gè)?3600個(gè)細(xì)胞：（800細(xì)胞/孔?1200細(xì)胞/孔）X3孔］。

注：推薦最佳相對(duì)離心力為350g，若采用其他相對(duì)離心力，對(duì)其進(jìn)行論證。

B.4結(jié)果計(jì)算

使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)程序來計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記的細(xì)胞核數(shù)目，測(cè)定離心前后的細(xì)胞數(shù)。按式（B.1）計(jì)算黏附百分比：

V=^X100% （B.1）

C

式中：

V——黏附百分比；

Nt 離心后細(xì)胞數(shù)；

Nc——離心前細(xì)胞數(shù)。

相對(duì)細(xì)胞黏附性比值按式（B.2）計(jì)算：

式中：

P——相對(duì)細(xì)胞黏附性比值；

Vi——膠原蛋白樣品各復(fù)孔的黏附百分比平均值;v2——陰性對(duì)照各復(fù)孔的黏附百分比平均值。

附錄C

（規(guī)范性）

細(xì)胞移行試驗(yàn)——細(xì)胞劃痕法

C.1試驗(yàn)原理

細(xì)胞劃痕法是測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的簡(jiǎn)潔方法，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其他硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至試驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間（例如24h），觀察周邊細(xì)胞是否遷移至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力。試驗(yàn)通常需設(shè)定對(duì)照組和供試品組，對(duì)照組包括對(duì)照材料組和空白對(duì)照組。通過不同組之間的細(xì)胞向劃痕區(qū)移行的比較，判斷供試品組細(xì)胞的遷移能力。

C.2器具、試劑及耗材

試驗(yàn)使用的器具、試劑和耗材如下：

a） 細(xì)胞培養(yǎng)孔板、記號(hào)（marker）筆、直尺、10/txL槍頭；

b） 無血清培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、如：NIH/3T3細(xì)胞或HaCaT細(xì)胞（人正常皮膚永生化角