1、一、冷凍技術概述 隨著生物學、醫學和低溫制冷技術的發展，低溫冷凍隨著生物學、醫學和低溫制冷技術的發展，低溫冷凍技術已逐漸形成的一門邊緣學科低溫生物學，該領域主技術已逐漸形成的一門邊緣學科低溫生物學，該領域主要應用是在保存各種細胞、組織、胚胎、器官甚至是活要應用是在保存各種細胞、組織、胚胎、器官甚至是活體的冷凍保存。體的冷凍保存。 在超低溫條件下動物種質細胞之所以能長期保存，是在超低溫條件下動物種質細胞之所以能長期保存，是因為種質細胞內一切新陳代謝過程中的化學變化被超低因為種質細胞內一切新陳代謝過程中的化學變化被超低溫所抑制，當溫度降到一定限度時，細胞內所有的化學溫所抑制，當溫度降到一定限度時，

2、細胞內所有的化學變化也就處于一種變化也就處于一種“暫停暫停”狀態而使細胞得以長期保存；狀態而使細胞得以長期保存；低溫保存的細胞以一定的方式復蘇后，又具有存活的能低溫保存的細胞以一定的方式復蘇后，又具有存活的能力。力。一、冷凍技術概述1.影響動物種質細胞冷凍保存的兩個關鍵因素：影響動物種質細胞冷凍保存的兩個關鍵因素： 冷凍模式冷凍模式 防凍劑防凍劑 1.1常用的冷凍模式包括程序降溫法和玻璃化法常用的冷凍模式包括程序降溫法和玻璃化法 程序降溫法程序降溫法 利用程序降溫儀，按照預先設計的利用程序降溫儀，按照預先設計的降溫程序將細胞降低至植冰溫度，再迅速降溫至零下降溫程序將細胞降低至植冰溫度，再迅速降

3、溫至零下35度，然后保存在液氮中的過程。度，然后保存在液氮中的過程。 一、冷凍技術概述 玻璃化法玻璃化法 指將經過不同防凍劑濃度平衡后的細胞指將經過不同防凍劑濃度平衡后的細胞直接投入到液氮中保存。高濃度防凍劑在快速降溫過程中直接投入到液氮中保存。高濃度防凍劑在快速降溫過程中由液態轉化為一種類似于玻璃狀的形態，而不形成冰晶，由液態轉化為一種類似于玻璃狀的形態，而不形成冰晶，不會產生細胞內冰晶形成所致的化學、物理損傷，使得冷不會產生細胞內冰晶形成所致的化學、物理損傷，使得冷凍技術更加簡潔，迅速，廉價。凍技術更加簡潔，迅速，廉價。 一、冷凍技術概述 1.2冷凍保護劑分為滲透性和非滲透性兩種冷凍保護劑

4、分為滲透性和非滲透性兩種 滲透性冷凍保護劑主要有丙二醇（滲透性冷凍保護劑主要有丙二醇（PROH）、二甲）、二甲基亞砜（基亞砜（DMSO)、甘油和乙二醇、甘油和乙二醇(EG)等。等。 滲透性冷凍保護劑主要通過細胞膜，降低溶液的冰滲透性冷凍保護劑主要通過細胞膜，降低溶液的冰 點，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質濃度。點，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質濃度。一、冷凍技術概述 非滲透性冷凍保護劑主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。非滲透性冷凍保護劑主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。非滲透性冷凍保護劑不能透過細胞膜，但可以增加細胞外溶非滲透性冷凍保護劑不能透過細胞膜，但可以增加細胞外溶質濃度，在細胞膜內外形成滲

5、透梯度，吸引細胞內水分外流，質濃度，在細胞膜內外形成滲透梯度，吸引細胞內水分外流，使細胞脫水。使細胞脫水。 各種冷凍保護劑都各有千秋，需要按一定比例混合使用，各種冷凍保護劑都各有千秋，需要按一定比例混合使用，以加強效果。冷凍保護劑的濃度很重要，它決定了細胞脫水以加強效果。冷凍保護劑的濃度很重要，它決定了細胞脫水的速率。的速率。一、冷凍技術概述2.細胞損傷假說細胞損傷假說 冷凍損傷是卵母細胞冷凍保存的主要障礙，有報冷凍損傷是卵母細胞冷凍保存的主要障礙，有報道認為冷凍常會使細胞膜，透明帶發生變化，細胞骨道認為冷凍常會使細胞膜，透明帶發生變化，細胞骨架被破壞，染色體出現異常等。架被破壞，染色體出現異

6、常等。 現在關于冷凍損傷有兩個假說：現在關于冷凍損傷有兩個假說： 胞內冰的形成，這是過快冷卻所產生的，冰晶胞內冰的形成，這是過快冷卻所產生的，冰晶會刺破細胞器，破壞細胞膜，造成冷凍損傷，因而冷會刺破細胞器，破壞細胞膜，造成冷凍損傷，因而冷卻速率越快，此損傷越大；卻速率越快，此損傷越大；一、冷凍技術概述 “溶質損傷溶質損傷”，也叫，也叫“溶液損傷溶液損傷”，這，這是由過慢冷卻所產生的，它使細胞在高濃度的是由過慢冷卻所產生的，它使細胞在高濃度的溶液中存在的時間過長而發生細胞失水，造成溶液中存在的時間過長而發生細胞失水，造成了不可逆的的損傷，因而冷卻速率越慢，此損了不可逆的的損傷，因而冷卻速率越慢，

7、此損傷越大。傷越大。 二、卵母細胞的冷凍保存研究1.影響卵母細胞冷凍的因素影響卵母細胞冷凍的因素 1.1冷凍保護劑的影響冷凍保護劑的影響 有研究認為有研究認為PROH比甘油和比甘油和DMSO相比，解凍后形相比，解凍后形態正常率和受精率效果更好態正常率和受精率效果更好, ,PROH使細胞質變為無定使細胞質變為無定型狀態，提高了膜的滲透性。甘油廣泛用于牛胚胎的型狀態，提高了膜的滲透性。甘油廣泛用于牛胚胎的冷凍，因為它毒性低；還有相關報道認為冷凍，因為它毒性低；還有相關報道認為DMSO對細對細胞骨架系統和糖酵解途徑有特殊的毒性。胞骨架系統和糖酵解途徑有特殊的毒性。二、卵母細胞的冷凍保存研究1.2冷凍

8、保存方法冷凍保存方法 由于慢速冷凍冷凍與超快速冷凍方法都需要昂貴的由于慢速冷凍冷凍與超快速冷凍方法都需要昂貴的程序化冷凍儀，推廣應用并不廣泛?，F在常用快速冷程序化冷凍儀，推廣應用并不廣泛?，F在常用快速冷凍方法即玻璃化法冷凍。朱士恩等應用凍方法即玻璃化法冷凍。朱士恩等應用OPS法玻璃化法玻璃化冷凍牛的卵母細胞，得到了很高的囊胚率，成功提高冷凍牛的卵母細胞，得到了很高的囊胚率，成功提高了冷凍效率。了冷凍效率。 Open pulled straw（OPS）：）： 用酒精燈將用酒精燈將025mi塑料塑料細管加熱拉成細管加熱拉成OPS管。保證管。保證OPS管壁內徑管壁內徑0810mm，管，管壁厚度約壁厚

9、度約008mm即可。冷卻后用刀片將其切開，細端長度即可。冷卻后用刀片將其切開，細端長度保持在保持在2cm左右。左右。二、卵母細胞的冷凍保存研究1.3卵母細胞成熟階段卵母細胞成熟階段 不成熟的卵母細胞在冷凍，解凍后受精率和卵裂不成熟的卵母細胞在冷凍，解凍后受精率和卵裂率都較低。未成熟卵母細胞的成熟率和受精率要比成率都較低。未成熟卵母細胞的成熟率和受精率要比成熟的卵母細胞的成熟率和受精率低很多，冷凍損傷對熟的卵母細胞的成熟率和受精率低很多，冷凍損傷對成熟的卵母細胞的影響更小。成熟卵母細胞比未成熟成熟的卵母細胞的影響更小。成熟卵母細胞比未成熟卵母細胞對冷凍的耐受性高。卵母細胞對冷凍的耐受性高。二、卵

10、母細胞的冷凍保存研究1.4 卵丘細胞的影響卵丘細胞的影響 研究發現包裹卵母細胞的卵丘細胞層數越多，解凍研究發現包裹卵母細胞的卵丘細胞層數越多，解凍后卵母細胞存活率越高。后卵母細胞存活率越高。Jack等比較冷凍等比較冷凍GV期卵母細期卵母細胞前后變化，發現致密的胞前后變化，發現致密的COC與裸卵相比具有較高的成與裸卵相比具有較高的成熟率。可能是卵丘細胞參與了卵母細胞的成熟，如果去熟率?？赡苁锹亚鸺毎麉⑴c了卵母細胞的成熟，如果去除卵丘細胞，成熟率則會大幅度降低。除卵丘細胞，成熟率則會大幅度降低。 三、實驗冷凍方法與保護劑對牛卵母細胞解凍后細胞冷凍方法與保護劑對牛卵母細胞解凍后細胞發育的影響發育的影

11、響 1. 1.卵母細胞的采集與成熟培養卵母細胞的采集與成熟培養 用帶有用帶有1212號針頭的號針頭的5ml5ml注射器抽取卵巢表面直徑為注射器抽取卵巢表面直徑為28mm28mm間卵泡中的卵母細胞和卵泡液。然后用間卵泡中的卵母細胞和卵泡液。然后用PBS+5PBS+5FBSFBS稀釋后，在體式鏡下檢出卵母細胞。稀釋后，在體式鏡下檢出卵母細胞。挑選胞質均勻或暗凝，卵丘細胞層部分脫落以及致密挑選胞質均勻或暗凝，卵丘細胞層部分脫落以及致密的卵丘的卵丘卵母細胞復合體進行成熟培養。卵母細胞復合體進行成熟培養。三、實驗2.2.卵母細胞的冷凍：卵母細胞的冷凍： 麥管冷凍：常規玻璃化麥管冷凍：常規玻璃化(O(O2

12、5mL25mL細管細管) )冷凍，將冷凍，將室溫調至室溫調至2020280280，在恒溫臺上使試驗用具及試劑得，在恒溫臺上使試驗用具及試劑得到充分平衡。試驗操作在到充分平衡。試驗操作在3838恒溫臺上進行，首先將恒溫臺上進行，首先將培養培養2828小時的卵母細胞轉移到小時的卵母細胞轉移到383855的預處理液，的預處理液，預平衡液中平衡預平衡液中平衡25253030秒：然后再轉移到秒：然后再轉移到1010EG+10EG+10DMSODMSO組成的組成的EDFS30EDFS30、EDFS40EDFS40玻璃化溶液，平衡玻璃化溶液，平衡25253030秒。最后將卵母細胞保存在麥管中并在液氮中保存秒

13、。最后將卵母細胞保存在麥管中并在液氮中保存l l周。周。三、實驗 OPS OPS冷凍：將部分培養冷凍：將部分培養28h28h的卵母細胞用帶有的卵母細胞用帶有lmllml塑料塑料注射針筒的口吸管連接的注射針筒的口吸管連接的OPSOPS管移入保護劑管移入保護劑1(EFS201(EFS20溶溶液中平衡液中平衡252530s30s，然后移入，然后移入EFS40EFS40，EFSS0EFSS0中平衡中平衡252530s)30s)；再將部分培養；再將部分培養28h28h的卵母細胞用帶有的卵母細胞用帶有lmllml塑塑料注射針筒的口吸管連接的料注射針筒的口吸管連接的OPSOPS管移入保護劑管移入保護劑2(1

14、02(10EG+10EG+10D D溶液中平衡溶液中平衡252530s30s，然后移入，然后移入EDFS30EDFS30，EDFS40EDFS40玻璃化溶液中平衡玻璃化溶液中平衡252530s)30s)。將含有卵母細胞。將含有卵母細胞的的OPSOPS管放入至液氮中冷凍保存。每支管放入至液氮中冷凍保存。每支OPSOPS管最好裝入管最好裝入5-65-6枚卵母細胞。枚卵母細胞。三、實驗3.3.卵母細胞解凍：卵母細胞解凍： 將含有卵母細胞部分直接浸入置于恒溫臺上的將含有卵母細胞部分直接浸入置于恒溫臺上的含有牛卵母細胞冷凍保存與體外孤雌培養技術研究含有牛卵母細胞冷凍保存與體外孤雌培養技術研究0.25mo

15、lL蔗糖解凍液的表面皿中，溶解后將卵母蔗糖解凍液的表面皿中，溶解后將卵母細胞用口吸管輕輕吹出并搖動混勻，在此液中平衡細胞用口吸管輕輕吹出并搖動混勻，在此液中平衡lmin，然后移入，然后移入0.15molL蔗糖解凍液中平衡蔗糖解凍液中平衡5min，以充分脫出卵母細胞內部抗凍劑。以充分脫出卵母細胞內部抗凍劑。 三、實驗4.4.結果與討論結果與討論 4.1. 4.1.將成熟培養將成熟培養28h28h后的卵母細胞經行麥管和后的卵母細胞經行麥管和OPSOPS管冷凍，管冷凍，2 2種方法采用相同保護劑處理，相同方法解凍，然后經行孤種方法采用相同保護劑處理，相同方法解凍，然后經行孤雌激活培養，比較不同冷凍方

16、式對牛卵母細胞的體外成熟雌激活培養，比較不同冷凍方式對牛卵母細胞的體外成熟及孤雌胚發育的影響，結果見表及孤雌胚發育的影響，結果見表l l：三、實驗4.2.本試驗選用本試驗選用2種不同的冷凍保護劑，對比兩種保護劑哪種更能有效種不同的冷凍保護劑，對比兩種保護劑哪種更能有效的保護牛卵母細胞。的保護牛卵母細胞。三、實驗卵泡液對冷凍后牛卵母細胞孤雌發育的卵泡液對冷凍后牛卵母細胞孤雌發育的影響影響 1.1.卵母細胞的采集與成熟培養卵母細胞的采集與成熟培養 2. 2.卵母孤雌激活胚胎的培養卵母孤雌激活胚胎的培養 3. 3.數據的統計與分析數據的統計與分析三、實驗4.結果結果本實驗將檢出的卵母細胞分別放到含有本實驗將檢出的卵母細胞分別放到含有0，5，10，20bFF成熟培養液中。比較不同濃度的卵泡液對冷凍后牛卵母成熟培養液中。比較不同濃度的卵泡液對冷凍后牛卵母細胞孤雌發育的影響，結果見表細胞孤雌發育的影響，結果見表4。四、卵母細胞冷凍的前景及展望 隨