1、2016大學生創新訓練項目大學生創新訓練項目 題目：外輸泵抑制劑NMP通過調節群體感應系統和自溶抑制鮑曼不動桿菌生物被膜的機制研究指導老師：王學林 于錄團隊成員： 王超越 丁少明 金波鮑曼不動桿菌為不動桿菌屬中最常見的一種革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界的水及土壤、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。鮑曼不動桿菌（Ab）是醫院感染的重要病原菌。近年來的感染在增多，且其耐藥性日益嚴重，已引起臨床和微生物學者的嚴重關注。Ab主要引起呼吸道感染，也可引發敗血癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎等。Ab在醫院的環境中分布很廣且可長期存活，對危重患者和CCU及ICU中的患者威脅很大，也

2、將此類感染稱做ICU獲得性感染。國內耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌發展很快，最近又出現“全耐藥”的鮑曼不動桿菌（Pan drug resistant acinetobacter baumanii），在臺灣以及內地均已出現，應引起高度警惕。隨著研究和調查的深入，積累數據的增加，抗菌藥物的耐藥性問題已引起各國政府，相關國際組織如WHO和OIE的重視，問題已顯得非常嚴重。當前，臨床分離的鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物產生的耐藥現象在國內外已極其普遍，多重耐藥菌正呈逐年增加之勢，由鮑曼不動桿菌引起的感染普遍存在，且耐藥水平越來越高，防治日益棘手16，致使鮑曼不動桿菌病的發病率仍然高居不下，成為當前鮑曼不動桿菌

3、耐藥性的最大特點。而由細菌生物被膜引起的感染性疾病在臨床治療上出現了巨大的困難17。至今未見針對細菌生物被膜的商品化抗菌藥物，所以，發現針對鮑曼不動桿菌生物被膜的抑制劑迫在眉睫。 由于外輸泵表達的增強導致細菌群體感應系統和自溶的增加，而群體感應系統和自溶與細菌生物被膜形成密切相關18。這樣，使用外輸泵抑制劑抗菌能同時降低細菌生物被膜和外輸泵介導的耐藥性，起到一舉兩得的作用。同時，通過對外輸泵抑制劑調節群體感應系統和自溶抑制細菌生物被膜的機制研究，進一步研究細菌的耐藥性機制，對于臨床應用具有重大意義19，采用有效的、可以臨床應用的耐藥抑制劑降低細菌的耐藥性。本研究將闡明NMP對鮑曼不動桿菌生物被

4、膜作用的分子機制20，為將NMP作為先導化合物進一步開發應用奠定基礎。 鮑曼不動桿菌能將進入菌體的藥物泵出體外，這種泵因需能量，故稱主動流出系統或者外輸泵4，由于這種主動外輸泵的存在及它對抗菌藥物選擇性的特點，使鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲桿菌對四環素、氟喹諾酮類、大環內酯類、氯霉素、-內酰胺類產生多重耐藥5。外輸泵抑制劑能抑制外輸泵的外排功能，使鮑曼不動桿菌體內藥物累積量明顯增加，降低抗菌藥物的最低抑菌濃度，恢復鮑曼不動桿菌對藥物的敏感性，減少耐藥突變頻率6。本研究中外輸泵抑制劑是N-甲基吡咯烷酮（NMP），它對RND外排泵表達的鮑曼不動桿菌

5、有抑制作用，并且對鮑曼不動桿菌多重耐藥性有部分逆轉作用，尤其是高濃度的NMP作用非常明顯7。 群體感應（Quorum-Sensing,QS）系統是指細菌能自發產生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調節微生物的群體行為的調控系統8。它是細菌細胞根據密度變化進行基因表達調控的一種生理行為，鮑曼不動桿菌可以向周圍環境釋放一類可以自由進出菌體的小分子信號因子高絲氨酸內（Homoserine Lactone，AHL），促進生物被膜的形成9，AHL是QS系統最典型的一類信號分子，建立有效檢測AHL的方法,對于研究鮑曼不動桿菌具有非常重要的意義10。 細菌自溶現象是細菌在自身水解酶類的作用下細胞

6、的消解過程，并伴隨胞內物質的釋放，一般分為誘導自溶和自然自溶11。 細菌耐藥性（Resistance）又稱抗藥性，系指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產生，藥物的化療作用就明顯下降12。目前，細菌耐藥性越來越嚴重，缺少有效的、可以臨床應用的耐藥抑制劑。形成生物被膜（Biofilm）是細菌抵抗不利外界環境所形成的一種形式，細菌生物被膜是指細菌粘附于固體或有機腔道表面形成微菌落，并分泌細胞外多糖蛋白復合物將自身包裹其中而形成的膜狀物13。細菌間的多糖蛋白復合物形成孔道維持細菌物質代謝。常見的形成細菌生物被膜的臨床致病菌有金黃色葡萄球（Staphylococcusaureus）、大腸埃希菌、

7、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿（AcinetobacterbaumanniiA.baumannii）等14。細菌生物被膜介導（Mediated）的耐藥性能導致藥物對細菌的最低抑菌濃度（MIC）提高10-100倍15，外輸泵介導的耐藥性也是細菌固有的重要重要耐藥機制，能顯著提高細菌對幾乎所有抗菌藥物的耐藥性，故急需闡明開發細菌生物被膜和外輸泵抑制劑。基于鮑曼不動桿菌的致病性和嚴重耐藥性，急需開發新型抗鮑曼不動桿菌藥物。 已有報道表明：外輸泵抑制劑能夠細菌生物被膜，但是具體機制不清。我們的前期研究初步證明：外輸泵抑制劑能夠通過調節群體感應系統和自溶抑制鮑曼不動桿菌生物被膜，在本研究中，我們將通過分子生物

8、學手段闡明這一機制。1.內容 （1）通過結晶紫染色分析eDNA考察NMP抗鮑曼不動桿菌生物被膜活性； （2）使用熒光定量PCR分析NMP對鮑曼不動桿菌RND和adeABC表達的抑制能力； （3）借助分析NMP對鮑曼不動桿菌群體感應系統AHLS信號分子的影響； （4）利用明膠酶譜分析NMP對鮑曼不動桿菌自溶成分自溶素的影響；2.重點難點 本研究的重點是通過結晶紫染色分析eDNA考察NMP抗鮑曼不動桿菌生物被膜活性，并以此為基礎進一步分析NMP的機制研究；研究難點是使用熒光定量PCR分析NMP對鮑曼不動桿菌RND和adeABC表達的過程中內參的設定。1 1、項目特色：、項目特色： 鮑曼不動桿菌是國

9、際上感染重要致病菌之一，我們選擇鮑曼不動桿菌為模型菌，使實驗更具代表性和一般性；2 2、項目創新點：、項目創新點： （1）本研究不同于以往的研究局限于一個因素的研究，而是通過自溶和QS群體感應系統兩個因素對細菌生物被膜進行研究，比以往的實驗更具創新性； （2）目前，國內外致力于群體感應系統和細菌生物被膜的形成機制的研究，未見將外輸泵抑制劑、自溶、群體感應系統和細菌生物被膜聯系起來，具有創新性。1 1、優越的團隊、優越的團隊條件：條件： （1）組內成員：王超越 丁少明 金波 （2）團隊條件：我們團隊一直對科學實驗有著濃厚的興趣，積極探索、善于發現、勇于創新、吃苦耐勞、善于思考、具有較強的語言表達能力。在學習上，我們努力學習，積極向上，奮力拼搏,王超越同學在2014和2015年獲得二等獎學金，同時在2015年被評為院優秀學生；丁少明和金波同學在2014年高教社杯全國大學生數學建模聯賽中獲得吉林省賽區一等獎。在生活上，我們細心負責，樂于溝通，真誠待人。2 2、充分