1、生命科學學院2011級本科畢業生論文利用廢水生產微生物絮凝劑的研究摘 要：從土壤中篩選得到的6株具有較高絮凝活性的菌種，以啤酒廢水為廉價培養基培養，用以降低成本。通過改變廢水預處理方法以及在廢水中添加各種碳、氮源及無機鹽等因子進行實驗。實驗結果表明，最佳絮凝劑產生菌為Y1，其最佳培養條件為：對啤酒廢水高溫滅菌，添加KH2PO4為2g/l，調pH為7.5-8.0，培養溫度30、搖床轉速180rpm、培養24h，在這樣的條件下，Y1菌種所產的絮凝劑對高嶺土懸濁液絮凝率達到90%以上，同發酵培養基的發酵液相比絮凝率相差無幾，結果說明利用啤酒酵母廢水來培養微生物產絮凝劑是可行的，也是經濟的。 關鍵詞：

2、微生物絮凝劑 培養條件 啤酒廢水1.前言1.1概論隨著我國社會工業化的發展，雖然帶動了經濟的發展，但是引起了各種棘手的環境問題。特別突出的是，最近幾年來水污染現象極為嚴重，已經嚴重危害人類健康及發展。因此，污水處理受到了社會各界的高度關注。由絮凝微生物生長過程中所產生的一種代謝產物，具有絮凝活性的高分子化合物，可以良好的沉淀、聚集污水中的金屬離子、懸浮顆粒、以及色素等有機物質，效果佳、具有生物降解特性，于環境和人類無毒害作用，亦不會二次污染。微生物絮凝劑是由微生物在生長過程中產生的一類具有絮凝活性的細胞代謝產物1。主要化學成分為粘多糖、糖蛋白、蛋白質以及DNA等高分子化合物，具有安全無毒害、高

3、效性、無二次污染、用途廣泛、可生物降解等特點2。目前微生物絮凝劑的研究以及應用依然處在實驗室中研究階段，用于實際工業的仍然是少數的，主要是因為用于生產微生物絮凝劑的培養基成本較高，難以大量培養。培養基中主要成分是碳源、氮源和無機鹽等，而實際生活和工業生產中所排放的各種污水廢水中主要的污染成分就是各種營養物質，碳氮源含量豐富。因此，可以利用污水作為基礎培養基通過添加少量無機鹽等來培養產絮凝劑微生物用以生產微生物絮凝劑，這樣不僅能解決培養基成本過高問題，同時還能降低廢水中的污染物，達到以廢治廢，廢水資源化利用的雙重目的3 10。1.2微生物絮凝劑進展以及研究1.2.1微生物絮凝劑的進展美國科學家B

4、utterfield在1935年從活性污泥中發現并篩選出來的菌膠團產生菌是最早發現的絮凝微生物4。1976年，J.Naknmura等從酵母菌、細菌、放線菌等214株菌株中篩選出19種具有絮凝能力的菌株。1997年suh.H-H等人發現了DP-152絮凝劑，這是首次發現桿狀細菌也能產生絮凝劑5-7。此后，英國、美國、德國、韓國、伊朗、日本、朝鮮等國的科學研究者對絮凝微生物以及絮凝劑投入了大量研究，并且已經取得了相應的成果。我國對微生物絮凝劑的研究是從90年代才剛剛起步的，中科院成都研究所張本蘭從活性污泥中篩選得到P.alcaligenes8724菌株能產絮凝劑；鄧述波等人從土壤中分離篩選得到了硅

5、酸鹽芽孢桿菌的新變種，該菌可以產生絮凝劑MBFA9，這些絮凝劑在水處理中都有一定的作用6-9微生物絮凝劑有著非常廣泛的應用前景，微生物絮凝劑對混濁液絮凝效果好，作用迅速、用量也少，同時具有良好的去色效果。但是微生物劑依然處于無法大批量生產的階段。所以降低微生物絮凝劑的生產成本，優化微生物絮凝劑產生菌的培養條件是工業化大量生產的關鍵點11。1.2.2微生物絮凝劑的作用機理微生物絮凝劑是生物大分子物質，其化學組成成分為多糖、糖蛋白、蛋白質、纖維素、DNA等能認為微生物絮凝劑絮凝的作用本質是有機高分子（例如：多聚糖、蛋白質、纖維素）同目標物質之間發生相互作用12。有關其作用機理前后提出過各種學說，例

6、如：“橋架作用”、“電性中和”及“化學反應”等作用機理13現在比較普遍的是“橋架作用”：微生物絮凝劑有可以與膠粒表面某些部分起作用的化學基團，微生物絮凝劑和膠粒相接觸的時候，基團能夠和膠粒表面產生反應而相互吸附，而絮凝劑的其他部分就伸在溶液里，能夠和另一有空位的表面膠粒吸附，這就是“橋架作用”。2 材料與方法2.1菌種來源與活化（1）實驗用菌來源于實驗室所儲藏的六種絮凝劑菌種，分別為Y1、C2、A3、F4、M10、M15。（2）配置好的活化培養基高溫滅菌，然后在超凈工作臺里倒試管斜面，等培養基凝固后，用接種環把Y1、C2、A3、F4、M10、M15分別接兩個試管斜面上，把試管放到電熱恒溫培養箱

7、里37度培養一天后取出放到冰箱里保存備用。2.2實驗材料和器材2.2.1實驗材料活化培養基（g/L）：稱量氯化鈉5，牛肉膏3，瓊脂18，蛋白胨10，并調pH7.07.2高溫滅菌后實用。斜面培養基：與活化培養基一樣。搖瓶發酵培養基（g/L）：葡萄糖20，磷酸氫二鉀5，磷酸二氫鉀2，氯化鈉0.1，硫酸銨0.2，尿素0.5，酵母膏0.5，硫酸鎂0.2，112度滅菌20min。廢水培養基：取啤酒發酵后排酵母廢水，稀釋10倍，加入磷酸二氫鉀（2g/L），葡萄糖（10g/l），尿素（1g/l）。將上述培養基均調節pH至7.58.0，112、20min高壓蒸汽滅菌。2.2.2實驗器材三角瓶、燒杯、量筒、移液

8、管、電子天平、培養皿、試管、涂布棒、接種環紫外可見分光光度計(752N, 上海佑科)、高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-75KBS，上海申安）、垂直凈化工作臺（SD-DJ，上海浦東偉普凈化設備廠）、電熱恒溫培養箱（DHP-9272，上海一恒科技有限公司）。2.3絮凝率的測定方法CaCl2溶液：1g無水氯化鈣，100mL蒸餾水。高嶺土溶液：4g高嶺土，1000mL蒸餾水。測定每個樣品時，分別取高嶺土懸液、氯化鈣水溶液各10ml 、0.5ml，很合均勻，從中取9.8ml，再取0.2ml發酵液加入小燒杯中，對照不加發酵液。用PH計在小燒杯中調節PH值到7.5-8.0，在此過程中充分混勻，倒入試管中。靜置半個

9、小時，先用觀測法觀察其絮凝劑絮凝效果，再用滴管吸取上清液到比色皿中，在紫外分光光度計中550nm處測其吸光值，并計算絮凝率：絮凝率公式如下：絮凝率=(A-B)/A*100%式中：A為對照液上清液550nm處的吸光值；B為樣品液上清液550nm處的吸光度。2.4廢水的優化處理條件選擇2.4.1廢水預處理選擇實驗把啤酒排酵母廢水混勻，稀釋10倍。然后進行三組實驗，分組六瓶（每瓶40ml廢水）：第一組對廢水進行先過濾后滅菌的處理；第二組進行先滅菌后過濾的處理；第三組進行只滅菌不過濾的處理方法。然后分別接種兩菌種，在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘，培養24小時 ，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝

10、率。2.4.2最佳碳源添加選擇實驗取一定量廢水搖勻，稀釋10倍，調節pH為7.5-8.0。然后分裝到搖瓶里（每瓶40ml），然后分別添加0.4g的葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙醇、乳糖，再做一個不添加任何碳源做空白對照。滅菌后在超凈臺里接種Y1菌。在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘，培養24小時，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝率2.4.3最佳氮源添加選擇實驗取一定量廢水搖勻，稀釋10倍，調節pH為7.5-8.0。然后分裝到搖瓶里（每瓶40ml），然后分別添加0.08g的尿素、硫酸銨、蛋白胨、酵母膏，再做一個不添加任何氮源做空白對照。滅菌后在超凈臺里接種Y1菌。在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘

11、，培養24小時，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝率。2.4.4最佳無機鹽添加選擇實驗取一定量廢水搖勻，稀釋10倍，調節pH為7.5-8.0。然后分裝到搖瓶里（每瓶40ml），然后分別添加0.2g的NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、FeSO4、（NH4）2HPO4、KCl、（NH4）3 PO4，再做一個不添加任何無機鹽做空白對照。滅菌后在超凈臺里接種Y1菌。在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘，培養24小時，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝率。2.4.5最佳無機鹽添加量實驗取一定量廢水搖勻，稀釋10倍，調節pH為7.5-8.0。然后分裝到搖瓶里（每瓶40ml），然

12、后分別添加0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0的KH2PO4（g/l)滅菌后在超凈臺里接種Y1菌。在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘，培養24小時，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝率。2.5發酵培養基對比實驗將六種菌種接種到配制好的發酵培養基與最佳啤酒廢水培養基（每瓶40mL）中，在搖床上30攝氏度， 180轉每分鐘，培養24小時，用高嶺土懸液法測吸光值，并計算絮凝率，做對照實驗。3結果與分析3.1廢水預處理結果與分析表1廢水預處理實驗結果絮凝率% Y1C2A3F4B10B15先過濾后滅菌10.67.35.66.89.210.5只滅菌不過濾46.735.933.736

13、.943.843.8先滅菌后過濾40.833.739.532.736.237.8由以上結果可以看出對啤酒排酵母廢水的處理先進行過濾再滅菌來培養六種產絮凝劑菌種，其結果都偏低。而對啤酒排酵母廢水進行先滅菌在過濾或者不過濾的處理方法則結果有了明顯的提高，其原因推斷為二：（1）可能是由于廢水中的固體雜質對pH具有一定的緩沖作用能夠使產絮凝劑菌在生長時的培養條件處于良好；（2）啤酒排酵母廢水中含有大量的酵母菌，直接高溫滅菌使得酵母菌死亡，而酵母菌的細胞膜破裂，細胞中的代謝產物、蛋白、生長因子等大量營養物質進入廢水中，相當于在廢水里添加了一定量的酵母膏。本次實驗可以說明對啤酒排酵母廢水按照只滅菌的處理即

14、可達到較好的預處理效果。3.2廢水最佳碳源添加選擇實驗結果表2廢水最佳碳源添加選擇實驗結果碳源葡萄糖蔗糖乙醇淀粉乳糖原液絮凝率%47.819.65.37.618.122.5實驗結果可以看出，添加葡萄糖的廢水培養基培養Y1菌種，其絮凝率對比原液有較大程度的提高，可以說明Y1菌種能夠利用葡萄糖做碳源。而添加二糖（蔗糖、乳糖）、醇類（乙醇）以及多糖（淀粉）對比原液空白，其結果顯示添加蔗糖、乙醇、淀粉碳源來培養Y1菌，結果絮凝率偏低而且不如原液空白的絮凝率高。所以可以說明在啤酒排酵母廢水中添加葡萄糖為碳源較好。這可能是因為在Y1菌的對數期能最有效利用的是葡萄糖，有助于菌體在對數期的時候大量產生代謝產物

15、。而添加二糖（蔗糖、乳糖）、醇類（乙醇）以及多糖（淀粉）使得絮凝率降低可能是添加物對絮凝作用或有抑制作用。所以可以在啤酒排酵母廢水中添加單糖（葡萄糖）來做為碳源添加。3.3廢水最佳氮源添加選擇實驗結果表3廢水最佳氮源添加選擇的實驗結果尿素硫酸銨蛋白胨酵母膏原液絮凝率%50.740.623.329.222.5由上表數據可見：在添加尿素和硫酸銨的培養基中Y1菌株生長較好。比較沒有添加氮源的原液廢水測的絮凝率，添加了尿素和硫酸銨的廢水培養基的絮凝率提高了一倍左右；而添加酵母膏和蛋白胨為氮源的培養基中的菌株也能生長，但對比原液廢水其絮凝率提高不是很明顯，其原因可能是添加的酵母膏和蛋白胨是天然的氮源，天

16、然氮源不利于菌株的快速吸收和利用，而絮凝劑的產生是在對數生長初期產生的初級代謝產物，所以產絮凝劑量低，而尿素和硫酸銨是合成氮源，能夠為處于對數期的菌體提供快速吸收的氮源，尿素的含氮量更高一些，所以對比添加硫酸銨的廢水培養基會絮凝率高一些。對比說明，對于啤酒排酵母廢水中，尿素是較好的氮源添加選擇。3.4最佳無機鹽添加選擇實驗結果結果如下表4ABCDEFGHI絮凝率30.615.196.080.966.942.993.190.622.5注：表中無機鹽A-I分別為NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、FeSO4、（NH4）2HPO4、 （NH4）3 PO4以及原液對照。由上表

17、數據分析可知：添加磷酸鹽類如KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2HPO4、（NH4）3 PO4的廢水培養基中Y1菌種生長相較其他添加鹽類的廢水培養基較好，可以使得絮凝率達到80%以上更高著達到96%效果顯著。磷元素是細胞膜中的磷脂以及細胞和中的核糖核酸的重要組成部分，有利于Y1菌在對數期快速大量增殖，促進產生初級代謝產物，另外。而添加了NaCl、CaCl2、FeSO4鹽的廢水培養基其絮凝率相比與原液不加鹽的廢水培養基都有一定的提高，Na+、Ca+、Fe+可能對絮凝效果有一定的促進作用。所以對于啤酒排酵母廢水選擇添加的鹽應該是KH2PO4。3.5最佳無機鹽添加量實驗結果結果如下0g/l0.2

18、g/l0.5g/l1.0g/l1.5g/l2.0g/l3g/l4g/l絮凝率%21.551.863.578.980.796.094.991.7由上表數據分析得：結果顯示，在逐步增加添加磷酸二氫鉀到廢水培養基中的量時，其絮凝率也在逐步增加，在添加磷酸二氫鉀量為2g/l的時候絮凝率達到最高值96%，隨后繼續增加磷酸二氫鉀的量，絮凝率隨之下降。所以添加磷酸二氫鉀的量為2g/l的時候絮凝率最高。3.6發酵培養基對比實驗結果發酵培養基培養結果Y1C2A3F4B10B15絮凝率%81.377.278.970.077.673.5廢水培養基培養結果Y1C2A3F4B10B15絮凝率%91.3488.4082.

19、7279.6781.4280.74結果分析：由以上數據顯示，Y1菌株無論是在發酵培養基還是優化過的廢水培養基中都有較好的生長態勢與產絮凝劑量。通過對比發酵培養基和廢水培養基的絮凝率數值，我們可以看出優化過的廢水培養基的絮凝率略好于發酵培養基，可能是因為滅菌后的啤酒排酵母廢水中有一些物質能夠促進絮凝，這也說明了將啤酒排酵母廢水進行簡單優化后可以作為廉價的培養基來進行產絮凝劑菌的培養，達到了廢水利用，以廢治廢的效果。3.7實驗結論取自啤酒發酵排酵母階段的廢水來培養產絮凝劑Y1、C2、A3、F4、M10、M15六種菌種時，Y1菌種產絮凝劑量最好。同時廢水培養基的最佳優化條件為：對廢水進行滅菌即可，添

20、加1g/l的尿素、2g/l的磷酸二氫鉀，180rmp，pH為7.5-8.0，培養溫度30，培養24h另外由于廢水水體里還有較為豐富的營養物質所以本著降低成本的目的其實葡萄糖為碳源可以不用添加。以上條件可以使Y1對高嶺土懸液的絮凝率高達96%。4.討論本實驗的主要目的在于利用廢水來培養產絮凝劑微生物并改變廢水的一定條件使得絮凝劑的產量增加。以廢水培養基對Y1、C2、A3、F4、M10、M15這六個菌種進行了發酵培養，初步確定了Y1菌的產絮凝劑量高，進而對Y1菌進行了控制變量法實驗以確定對廢水培養基的最佳優化條件。實驗中以廢水的預處理、添加碳氮源以及無機鹽和添加無機鹽的量為變量因素進行了實驗，以尋

21、求最佳廢水優化處理條件。首先對廢水進行預處理方法的選擇入手，因為廢水中含有數量較多的酵母菌，而酵母菌的存在會對廢水中的營養物質進行不斷的消耗另外也會產生代謝產物從而影響到產絮凝劑菌的生長繁殖與代謝。而考慮到實際生活當中處理大量廢水過濾難度較大所以又采取了滅菌后過濾和不過率的實驗。而實驗結果恰恰顯示為滅菌后不過濾效果好。但是實驗設計還是有不足之處，例如在實際廢水處理中難以實現高溫滅菌（成本太高），又如在實際中處理廢水的時候并不是在無菌條件下進行的等?？紤]到此，又設計了不滅菌的廢水培養基培養菌種，但是結果很不理想（結果未曾在上文中列出），可能是菌體在不滅菌的廢水中不能生長，也有可能是廢水中的酵母菌

22、產生的代謝產物影響了絮凝效果。在對最佳碳源選擇添加時，添加的葡萄糖的培養基培養24h后其結果較好。可以說明產絮凝微生物能夠利用葡萄糖做為碳源。實驗對比中還有二糖與多糖類碳源物質，雖然在24h后的結果對比葡萄糖并不好，但是推斷如果在實驗36h或者48h時效果會有所提高，因為后期二糖與多糖會被分解為單糖，依然能被菌種利用。但是測定菌種最佳絮凝率時期為培養24h，雖然添加二糖與多糖能在后期被分解為單糖，但是絮凝率的提高是有限的，由于實驗條件有限，所以原培養基中氮源的成分不名。故在添加外來氮源時選擇了兩類氮源，一是有機氮源也就是天然氮源，另一類是無機氮源。其結果顯示Y1產絮凝劑在添加無機氮源的廢水培養

23、基上測的絮凝率較好。如果能降最佳碳源與最佳氮源組合在一起，進一步的進行對比實驗，則能得到更加好的效果。在對培養基的預處理與添加碳氮源的優化條件確定后，考慮到廢水培養基中必要的營養物質以足但測的的絮凝率依然處于未達到預期值，所以分析可能缺少了必要的無機鹽類物質。在對添加最佳無機鹽成分確定的實驗中，先添加了NaCl、MgSO4、CaCl2、FeSO4，其結果顯示添加磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀結果有了極為顯著的提高。當時推斷為K+為關鍵元素，故又進行了添加KCl的對比實驗（結果極差上文沒有提及），其結果顯示K+并非關鍵元素，又推斷是P+，所以又對比了的實驗其測的的絮凝率結果同樣顯著提高，說明磷元素是關鍵

24、性的元素?？赡苁瞧【婆沤湍笍U水中以為前期酵母的大量生長繁殖將水體中的磷元素大量消耗導致水體磷元素含量極低。而KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2HPO4、（NH4）3 PO4中對比可知磷酸二氫鉀效果稍好一些，所以可以選擇磷酸二氫鉀作為無機鹽的添加。對與無機鹽的添加量，由于到了實驗后期，實驗設計了一個簡單的梯度實驗結果粗糙但可得出結論：在啤酒排酵母廢水水體中添加磷酸二氫鉀量為2g/l時效果最為顯著。在每個單項條件廢水培養優化選擇探究的時候，作為對比項的原液廢水未添加任何外來物質，而且整體實驗結果也沒有綜合起來與發酵培養基做對比，所以得到的結果好壞未知，所以有做了最后一項對比。實驗結果顯示在優

25、化后的啤酒排酵母廢以足以代替發酵培養基，其效果甚至略好與發酵。只是由于實驗條件，不能分析為何優化后的廢水培養基效果略好與發酵培養基，也是實驗設計的不足之處。本次實驗還有很多的不足之處，例如實驗初期在廢水預處理選擇時忘記調節pH而導致結果不理想，反復多次都沒有注意到這個問題，后來經老師提醒才發現這個問題，實驗才能繼續進行下去；實驗中前后原液培養細菌測得的絮凝率數據不同，其原因應該是同一批廢水擱置時間過久導致水中營養物質有一定的消耗導致的，可以設計實驗為取得廢水先進行高溫滅菌后再冷凍保存。另外在實驗中發現，絮凝率高的搖瓶里的發酵液顏色會相比其他搖瓶要淺一些，這說明實驗中產生的絮凝劑具有一定的脫色能

26、力。由于時間緊迫所以沒有對其脫色能力進行進一步的研究。本次實驗還可以用無機絮凝劑與優化后的廢水培養出來的微生物絮凝劑做一個對比，也沒有來得及做。經過這次畢業論文實驗我學習到了許多許多。雖然實驗結果顯得粗糙，有偶然因素，也有實驗設計的不足，還有必要專業知識把握不準導致，但是最終在老師的幫助下能夠完成論文也是一種收獲。參考文獻1周 旭，王 竟，周集體，朱曉兵利用廢棄物生產微生物絮凝劑絮凝研究化工裝備技術，2003, 24 (4) : 48-512王 蘭，唐 靜，趙 璇微生物絮凝劑絮凝機理的研究方法環境工程學報，2011, 5 (3) : 481-4883 Y H,Rogers P L Produc

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