1、還原型谷胱甘肽對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響                 作者：王進(jìn)，王一彪，楊海英，趙麗麗，孔春妍【摘要】  目的  研究還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的影響。方法  建立心肌細(xì)胞A/R損傷模型，隨機(jī)分為組：A組，正常對照組；B組，單純?nèi)毖?復(fù)氧(A/R低氧2h，復(fù)氧1h)組；C、D、E組為還原型谷胱甘肽處理組，加入還原型谷胱甘肽(GSH)分別使其終濃度為

2、40、80、160 mg/L，后A/R。于復(fù)氧后測定各組培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)變化及細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞存活率。結(jié)果  與正常組相比，單純低氧/復(fù)氧組LDH漏出量、MDA水平顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。與缺氧/復(fù)氧組比較，各谷胱甘肽處理組上述變化明顯減輕(P<0.05)。結(jié)論  還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細(xì)胞A/R損傷具有保護(hù)作用，并具有濃度依賴性。    【關(guān)鍵詞】  還原型谷胱甘肽  心肌細(xì)胞  缺氧  復(fù)氧  &

3、#160; The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes    【Abstract】  Objective  To study the effects of reduced glutathione sodium(GSH)  on  anoxia /reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes.Meth

4、ods  A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established. The cells of neonatal rats  were randomly divided into five groups: control group(A): without any treatment; A/R group(B):2-hour anoxia followed by 1-hour reoxygenation; GSH conditioned group(C):adding GSH into culture me

5、dium till the final concentration of 40mg/L then A/R; GSH conditioned group (D):adding GSH into culture medium till the final concentration of 80mg/L then A/R; GSH conditioned group (E):adding GSH into culture medium till the final concentration of 160mg/L then A/R. The activity of lactate dehydroge

6、nase(LDH)，the contents of cellular  melondadehyde(MDA) and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results  Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability(P<0.01). Compared

7、with group B，the GSH conditioned groups significantly attenuated these changes(P<0.05).Conclusion  GSH could be a protective effect on A/R injury of neonatal rat cardiomyocytes in a concentration dependent manner.    【Key words】 reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia

8、 reoxygenation    1  與方法    1.1    1.2  乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)  無菌取出生13天大鼠乳鼠心臟，剪碎后用0.25胰酶消化45次，取除第1次以外的上清，用含15胎牛血清的高糖DMEM 中止消化，離心取心肌細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)液，集中混勻制成懸液，應(yīng)用差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，以5×105/ml的培養(yǎng)密度接種于孔培養(yǎng)板中， 在CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液。    1.3  實驗分組及操作程序&#

9、160; 試驗分為組，每組重復(fù)孔，A組為正常對照組（培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3h結(jié)束實驗）；B組為單純?nèi)毖鯊?fù)氧組（A/R  缺氧2h，復(fù)氧1h）：將培養(yǎng)板置于充有99.氮?dú)獾娜毖醴跤髦?7密閉培養(yǎng)2h，再以5氧氣二氧化碳進(jìn)行復(fù)氧1h；C組，D組，E組為古拉定處理組，加入古拉定使其終濃度分別為40、80、160mg/L。各組缺氧前、復(fù)氧前均給。    1.4  實驗檢測指標(biāo)  (1)計數(shù)細(xì)胞搏動：在倒置顯微鏡觀察并計數(shù)心肌細(xì)胞搏動的頻率及節(jié)律。(2)細(xì)胞存活率計數(shù)：采用臺盼藍(lán)排斥法檢測，各組取少許細(xì)胞混懸液，0.4%臺盼藍(lán)混勻2min

10、，按白細(xì)胞計數(shù)法在光鏡下計數(shù)藍(lán)染細(xì)胞。臺盼藍(lán)攝取率藍(lán)染細(xì)胞（藍(lán)染細(xì)胞未藍(lán)染細(xì)胞）×100%。(3)LDH及MDA活性及含量測定：實驗結(jié)束后按試劑盒說明測定。    1.5  學(xué)方法  數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)    2  結(jié)果    2.1  古拉定對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞搏動的影響  正常培養(yǎng)對照組心肌細(xì)胞搏動相對恒定，節(jié)律規(guī)則；A/R組心肌細(xì)胞搏動頻率減慢，搏動幅度減弱，節(jié)律不齊，有部分停搏，與對照組相比，差異有非常顯著性

11、（P<0.01)；各古拉定處理組明顯逆轉(zhuǎn)A/R 損傷造成的搏動頻率和節(jié)律異常，與A/R 組比較差異有顯著性（P<0.05)。    2.2  古拉定對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷LDH及MDA的影響  結(jié)果表明，A/R心肌損傷是十分明顯的，而古拉定能明顯減輕這種損傷，古拉定處理組各觀察指標(biāo)均差異有顯著性，因此提示古拉定對于缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損害具有保護(hù)作用，且存在量效關(guān)系，見表1。    表1  還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷LDH及MDA的影響  (x±s) 

12、;   注：B組與A組比較，P0.01；與B組比較，*P0.01；與B組比較，*P0.05    3  討論    3.1  還原型谷胱甘肽對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響  大量研究表明，缺血再灌注期間大量氧自由基的產(chǎn)生可造成細(xì)胞損傷。氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞損傷主要環(huán)節(jié)為作用于細(xì)胞外基質(zhì)，使膠原和透明質(zhì)酸崩解，使膜磷脂結(jié)構(gòu)的多聚不飽和脂肪酸過氧化而直接損傷細(xì)胞膜；肌漿網(wǎng)和線粒體崩潰，心肌細(xì)胞在缺氧缺糖條件下，ATP產(chǎn)生減少，代謝障礙，代謝產(chǎn)物堆積，使膜穩(wěn)定性降低，溶酶體釋放，導(dǎo)致生物損傷、變性

13、，使LDH釋放在培養(yǎng)基中，同時再給氧時氧自由基增加，細(xì)胞膜受攻擊，細(xì)胞膜損傷。細(xì)胞內(nèi)LDH進(jìn)一步增加，故LDH釋放量是觀測缺血再灌注損傷重要指標(biāo)。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，其含量變化可作為評定自由基生成及對膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞的指標(biāo)。本實驗從培養(yǎng)的未成熟鼠心肌細(xì)胞入手，排除了在體和離體灌注模型中神經(jīng)、體液因素及其他混雜細(xì)胞因素的影響，直接利用還原型谷胱甘肽處理培養(yǎng)的未成熟鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽各濃度組均可降低缺氧復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞死亡率，減少細(xì)胞內(nèi)LDH漏出，減少細(xì)胞內(nèi)MDA生成，且存在量效關(guān)系，表明還原型谷胱甘肽對未成熟鼠心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。  

14、60; 3.2  還原型谷胱甘肽對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制  還原型谷胱甘肽(GSH)對清除自由基有重要作用，它是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能有效清除氧化產(chǎn)生的自由基，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定，并在使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害方面起重要作用4。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用下對有機(jī)過氧化物(ROOH)和無機(jī)過氧化物(H2O2)起重要清除作用，其還可以起維生素C還原劑的作用，使維生素C成為還原型而不斷清除超氧自由基。近期有研究表明5，GSH可維持線粒體內(nèi)膜巰基基團(tuán)的還原狀態(tài)。當(dāng)GSH含量下降，內(nèi)源性自由基攻擊線粒體蛋白巰基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影響線粒體氧化代謝的3個關(guān)鍵酶及傳遞鏈中酶的活性，NADH減少，ATP產(chǎn)生減少。另一方面，導(dǎo)致膜蛋白巰基氧化交聯(lián)，構(gòu)型改變，線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道打開，鈣釋放增加，胞漿鈣上升，激活細(xì)胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷或死亡。本實驗表明補(bǔ)充外源性GSH，對保護(hù)細(xì)胞膜的功能可能具有重要意義，對臨床各種疾患造成的心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷有保護(hù)作用。