1、拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望拉曼光譜技術拉曼光譜技術(jsh)(jsh)在植物細胞壁研究在植物細胞壁研究中的應用以及展望中的應用以及展望細胞(xbo)生物學 2014年4月8日第一頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望2目錄(ml)一、維管形成層及木質部細胞細胞壁概述二、拉曼光譜技術原理及可用于研究植物細胞壁的拉曼顯微(xin wi)技術三、如何利用拉曼光譜技術研究植物細胞壁第二頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望截至 2010年，全世界石油儲藏量為 13830億桶，日消耗量為 8740萬桶；天然氣儲量為 187.1萬億立方米，年消耗量為 3.

2、1萬億立方米；煤炭儲量為 8600億噸，年消耗量為 72.7億噸（statistical review of world energy full report 2011）。不斷增加的能源消耗量使石油，天然氣和煤炭資源在 最多43 年，62 年和 120 年后將枯竭。世界靠科技、工具與能源來改變，工業革命、科技革命和信息革命都改變了世界格局，當今的世界格局是西方掌握的先進科技與發達信息以及石油、天然氣的分布劃分而成的。而下一場能源革命已經悄悄在美國和加拿大展開頁巖氣！美國已經擁有了生產頁巖氣的技術與批量生產的能力，五年之后就將生產出足以替代石油的新型清潔能源，加上美國國內的石油與天然氣開發也逐步

3、啟動，二戰后按石油儲藏與生產、使用來劃分的世界格局即將破局，中東的地位大幅下降，甚至會淪為一個亂攤子；俄羅斯靠出口石油的經濟將會一蹶不振。互聯網大數據時代讓世界從此沒有孤島，能源革命直接決定世界的未來！僅僅是頁巖氣革命么？不！核能不可再生而且存在風險，太陽能，風能，地熱能，尤其是生物質能植物利用太陽能，通過碳同化的過程將吸收的二氧化碳轉變為有機物，儲存于植物體內。生物質能的形成過程由植物體自身完成，同時消耗掉大氣中的二氧化碳，維持大氣平衡。同時全世界范圍內生物質資源總量十分豐富。木材是人們利用生物質能源的主要形式。木材即植物的次生木質部，它由木本植物的一種側生分生組織維管形成層活動而 產生，因

4、此對維管形成層發育與遺傳(ychun)調控的研究是使人們了解木材形成，提高木材產量和利用率的基礎。第三頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望要解決(jiju)的問題木材形成與形成層的活動緊密相連 木材的次生木質部是形成層細胞分裂形成的,形成層在活動期內的活動變化不僅影響著木質部細胞形成的數量,同時決定著木材的構造和其物理化學性能。v形成層紡錘形細胞是如何分化出各種類型樣式的木質部細胞?v 分化出來的木質部細胞是怎么生長的,其在發育過程中會發生什么的變化?而這些變化又與什么因素有關?v 從細胞生物學和解剖形態學的水平來看，木材生長發育形成過程中細胞形態結構發生了哪些(nxi)變

5、化？v 在細胞水平和組織水平上來說，木材生長過程中發生了哪些細胞力學性質和化學成分分布的變化？ 這些問題,對于實現木材性質的改良和定向培育提供重要的理論依據。第四頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望1.1 木質部細胞(xbo)的細胞(xbo)壁結構胞間層(intercellular layer) 細胞胞間層(intercellular layer)在分裂時，最初形成的一層是由果膠質組成的細胞板(cell plate)，它把兩個子細胞分開，這層就是胞間層，又稱中層(middle lamella)。初生壁(primary wall) 隨著子細胞的生長，原生質向外分泌纖維素，纖維

6、素定向地交織成網狀，而后分泌的半纖維素、果膠以及結構蛋白填充在網眼之間，形成質地柔軟的初生壁。次生壁(secondary wall) 很多細胞只有初生壁，如分生組織細胞、胚乳細胞等。但是，某些特化的細胞，例如纖維細胞、管胞、導管等在生長接近定型時，在初生壁內側沉積纖維素、木質素等次生壁物質，且層與層之間經緯交錯。由于次生壁質地的厚薄與形狀的差別，分化出不同(b tn)的細胞，如薄壁細胞、厚壁細胞、石細胞等.形成層細胞分化為未成熟木質部細胞，未成熟木質部細胞繼續分化。其中包括細胞壁沉積的重要過程第五頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望ML 胞間層；CW1 初生壁；S1 次生壁

7、外層(wi cn)； S2 次生壁中層； S3 次生壁內層第六頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望構成細胞壁的成分中，多糖，蛋白質、酶類以及脂肪酸等細胞壁中的多糖主要是纖維素、半纖維素和果膠類纖維素構成微團，微團組成微纖絲，微纖絲再組成大纖絲，構成細胞壁支架次生(cshng)細胞壁中還有大量木質素1.2 細胞壁結構(jigu)成分第七頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望1.3 細胞壁形成(xngchng)細胞壁的形成是多種細胞器配合作用的結果。新細胞壁的形成開始于細胞分裂的晚后期或早期。細胞分裂時，在母細胞的赤道板面上，分泌囊泡(secretory ve

8、sicles)不規則地匯聚在一塊，逐漸整齊地排列成片，組成成膜體(phragmoplast)。成膜體中的囊泡膜相互融合與連接(linji)形成細胞的質膜，其中的內含物連成一體構成細胞板，這是雛形的中層結構。細胞板組成后，高爾基體小泡運輸造壁物質釋放到質膜外，以充實新形成的壁。當細胞板中逐漸有果膠質和少量纖維素分子不斷地填充和摻入時便構成了中層，在中層兩側陸續有纖維素和半纖維素等物質的沉積則形成了質地柔軟的初生壁，這時兩個子細胞便形成。此后，大多數細胞的初生壁內側又分層、定向地沉積著纖維素分子，它們經緯分明地交叉加固，這是增強植物體支持能力的重要基礎。纖維素分子的定向分層沉積與微管的活動有關，秋

9、水仙素(colchicine)可阻止微管的形成，抑制纖維素分子的定向排列。微管的另一個重要作用是使新形成的細胞板上保留某些通道，參與胞間連絲的形成，使原生質在兩個子細胞間能保持聯系。第八頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望1.4 胞間連絲當細胞板尚未完全形成時，內質網的片段或分支，以及部分的原生質絲(約400nm)留在未完全合并(hbng)的成膜體中的小囊泡之間，以后便成為兩個子細胞的管狀聯絡孔道，這種穿越細胞壁、連接相鄰細胞原生質(體)的管狀通道被稱為胞間連絲(plasmodesma)。胞間連絲的數量和分布與細胞的類型，所處的相對位置和細胞的生理功能密切相關。胞間連絲的功

10、能：物質交換&信號傳遞 第九頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望1.5 細胞壁的功能(gngnng)對于細胞壁的功能，目前較肯定的有以下幾個方面：維持細胞形狀，控制細胞生長 細胞壁增加了細胞的機械強度，并承受著內部原生質體由于液泡吸水而產生的膨壓，從而使細胞具有一定的形狀，這不僅有保護原生質體的作用，而且維持了器官與植株的固有形態。另外，細胞壁控制著細胞的生長，因為細胞要擴大和伸長的前提是要使細胞壁松馳和不可逆伸展。物質運輸與信息傳遞 細胞壁允許離子、多糖等小分子和低分子量的蛋白質通過，而將大分子或微生物等阻于其外。因此，細胞壁參與了物質運輸、降低蒸騰作用、防止水分

11、損失(次生壁、表面的蠟質等)、植物水勢調節等一系列生理活動。細胞壁上紋孔或胞間連絲的大小受細胞生理年齡和代謝活動強弱的影響，故細胞壁對細胞間物質的運輸具有調節作用。另外，細胞壁也是化學信號(激素、生長調節劑等)、物理信號(電波、壓力(yl)等)傳遞的介質與通路。防御與抗性 細胞壁中一些寡糖片段能誘導植保素（phytoalexin）的形成，它們還對其它生理過程有調節作用，這種具有調節活性的寡糖片斷稱為寡糖素(oligosaccharin)。第十頁，共六十四頁。光譜(gungp)分類原子原子(yunz)發射光譜（發射光譜（AES）、原子）、原子(yunz)熒光光譜（熒光光譜（AFS）、）、X射線射

12、線熒光光譜法（熒光光譜法（XFS）、分子熒光光譜法（）、分子熒光光譜法（MFS）等）等紫外可見光法（紫外可見光法（UV-Vis）、原子吸收光譜（）、原子吸收光譜（AAS）、紅外觀光譜（）、紅外觀光譜（IR）、核磁共）、核磁共振（振（NMR）等）等拉曼散射光譜（拉曼散射光譜（Raman）2 拉曼光譜技術 第十一頁，共六十四頁。19231923年，德國物理學家年，德國物理學家A.SmekalA.Smekal從理論上預言了光的非彈性散射的存在。從理論上預言了光的非彈性散射的存在。（A. Smekal，Nature 11 (1923) 873） 19281928年，印度物理學家年，印度物理學家C. V

13、. RamanC. V. Raman在用汞燈的單色光來照射在用汞燈的單色光來照射CClCCl4 4液體時，在液體的散射光中觀測到了頻率低于入射光頻率的新液體時，在液體的散射光中觀測到了頻率低于入射光頻率的新譜線。在拉曼等人宣布了他們譜線。在拉曼等人宣布了他們(t men)(t men)的發現的幾個月后，蘇聯物理學家蘭德斯別爾格等也獨立地報道了晶體中的這種效應的存在。的發現的幾個月后，蘇聯物理學家蘭德斯別爾格等也獨立地報道了晶體中的這種效應的存在。（C.V. Raman, K.S. Krishman, Nature 121(1928) 501） 光照射到物質上時會發生非彈性散射，散射光中除有與激

14、發光波長相同的彈性成分（瑞利散射）外，還有比激發光照射到物質上時會發生非彈性散射，散射光中除有與激發光波長相同的彈性成分（瑞利散射）外，還有比激發光波長長的和短的成分，后一現象統稱為拉曼（光波長長的和短的成分，后一現象統稱為拉曼（RamanRaman）效應。）效應。2.1拉曼散射效應(xioyng)的發現第十二頁，共六十四頁。從理論到技術拉曼散射效應的進展1928928年，年，印度物理學家印度物理學家拉曼（拉曼（C.V.RamanC.V.Raman）首次發現拉曼散射效應，榮獲首次發現拉曼散射效應，榮獲19301930年的諾貝爾物理學獎，拉曼年的諾貝爾物理學獎，拉曼也成為自然科學亞洲諾獎第一人。

15、也成為自然科學亞洲諾獎第一人。1928-19401928-1940年，年，拉曼光譜成為研究分子結構的主要手段。因為拉曼光譜頻率及強度、偏振等標志著散射物質的性質。從這些拉曼光譜成為研究分子結構的主要手段。因為拉曼光譜頻率及強度、偏振等標志著散射物質的性質。從這些資料可以導出物質結構及物質組成成分的知識。這就是拉曼光譜具有廣泛應用的原因。資料可以導出物質結構及物質組成成分的知識。這就是拉曼光譜具有廣泛應用的原因。1940-19601940-1960年，年，拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因為拉曼效應太弱（約為入射光強的拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因為拉曼效應太弱（約為入射光強的1010-6-6）

16、，并要求被測樣品的體），并要求被測樣品的體積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等。積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等。4040年代中期，紅外技術的進步和商品化更使拉曼光譜的應用一度衰年代中期，紅外技術的進步和商品化更使拉曼光譜的應用一度衰落。（原始的拉曼光譜以汞弧燈為光源落。（原始的拉曼光譜以汞弧燈為光源, ,用常規攝譜儀做色散系統用常規攝譜儀做色散系統, ,出現的譜線極其微弱出現的譜線極其微弱, ,限制了拉曼光譜的發限制了拉曼光譜的發展。）展。）19601960年以后，年以后，激光技術的發展使拉曼技術得以復興。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等優點，激光技術的發展使拉曼技術得以復興。由于激

17、光束的高亮度、方向性和偏振性等優點，成為拉曼光譜的理想光源。而過濾器的發展過濾掉瑞利散射，計算機技術的發展使大數據分析成為可能成為拉曼光譜的理想光源。而過濾器的發展過濾掉瑞利散射，計算機技術的發展使大數據分析成為可能。隨探測技術的改進和對被測樣品要求的降低，目前在物理、化學、生物、工業等各個領域拉曼光譜得。隨探測技術的改進和對被測樣品要求的降低，目前在物理、化學、生物、工業等各個領域拉曼光譜得到到(d do)(d do)了廣泛的應用，越來越受研究者的重視。并且形成了一門光譜學的分支了廣泛的應用，越來越受研究者的重視。并且形成了一門光譜學的分支拉曼光譜學。拉曼光譜學。重要學術會議重要學術會議：國

18、際拉曼光譜學大會國際拉曼光譜學大會(Thelnternational Confer-enceon Raman Spectroscopy,ICORS)第十三頁，共六十四頁。2.2拉曼(Raman)光譜(gungp)基本原理00透射透射(tu sh)光光入射光入射光散射光散射光散射是光子與分子發生散射是光子與分子發生(fshng)碰撞的結果碰撞的結果拉曼光譜是研究分拉曼光譜是研究分子和光相互作用的子和光相互作用的散射光的頻率散射光的頻率第十四頁，共六十四頁。瑞利（瑞利（rayleigh）散射）散射(snsh)： 彈性碰撞；無能量交換，僅改變方向；拉曼（拉曼（raman）散射：）散射： 非彈性碰撞；

19、方向改變且有能量交換；Rayleigh散射散射(snsh)Raman散射散射(snsh)E0基態，基態， E1振動激發態；振動激發態； E0 + h 0 ， E1 + h 0 激發虛態；激發虛態；獲得能量后，躍遷到激發虛態獲得能量后，躍遷到激發虛態. h E0E1V=1V=0h 0h 0h 0h( 0 + )E1 + h 0E0 + h 0h( 0 - )激發虛態第十五頁，共六十四頁。Raman散射:Raman散射的兩種躍遷(yuqin)能量差： E=hE=h( ( 0 0 - - ) )產生產生stokesstokes線；強；線；強；基態分子多；基態分子多； E=hE=h( ( 0 0 +

20、+ ) )產生產生anti-stokesanti-stokes線；線；弱；弱；RamanRaman位移：位移：RamanRaman散射光與入射散射光與入射光頻率差光頻率差；ANTI-STOKES 0 - RayleighSTOKES 0 + 0h( 0 + )E0E1V=1V=0E1 + h 0E2 + h 0 h h 0h( 0 - )第十六頁，共六十四頁。 Stocks linesanti-Stockes linesRayleigh scatteringCCl4的拉曼光譜 斯托克斯線和反斯托克斯線統稱為拉曼譜線。由于在通常情斯托克斯線和反斯托克斯線統稱為拉曼譜線。由于在通常情況下，分子絕大

21、多數處于況下，分子絕大多數處于(chy)(chy)振動能級基態，所以斯托克斯振動能級基態，所以斯托克斯線的強度遠遠強于反斯托克斯線。線的強度遠遠強于反斯托克斯線。/cm-1第十七頁，共六十四頁。拉曼位移拉曼位移(wiy)（Raman shift） v即散射光頻率與激發光頻之差。由于拉曼位移v只取決于散射分子的結構(jigu)而與vo無關，所以拉曼光譜可以作為分子振動能級的指紋光譜。適用(shyng)于分子結構分析與入射光波長無關第十八頁，共六十四頁。拉曼是指紋拉曼是指紋(zhwn)光譜光譜 i = o- (cm-1) 500 1000 1500 2000 2500 3000 350020000

22、150001000050000Intensity (A.U.)OH stretchingCH3 Stretching ModesSkeletal BendingCCO modesOH BendingCH3 and CH2 Bending Modes甲醇甲醇(ji chn)vs. 乙醇乙醇 CH3OH vs. CH3CH2OH 第十九頁，共六十四頁。對不同物質Raman 位移不同；對同一物質與入射光頻率無關；是表征分子振-轉能級的特征物理量；是定性與結構分析的依據；拉曼線對稱(duchn)地發布在瑞利線兩側，長波一側為斯托克斯線，短波一側為反斯托克斯線；斯托克斯線強度比反斯托克斯線強2.3拉曼光

23、譜的特征(tzhng) 第二十頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望2.4拉曼光譜技術在植物學研究(ynji)中的優勢 分辨率高（at the micrometer level ;0.5um） 由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。 而且,拉曼顯微鏡物鏡可以將激光束進一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。 非損傷性測量（比如超薄切片(qi pin)用鋨酸） 樣品用量少（ug級） 由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得。而且,拉曼顯微鏡物鏡可以

24、將激光束進一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。 靈敏度高 利用共振拉曼效應,可以用來有選擇性地增強大生物分子特個發色基團的振動,這些發色基團的拉曼光強能被選擇性地增強1000到10000倍。 不受水溶液影響（水的紅外吸收非常強烈） 固體樣品可直接測定，無需制樣第二十一頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望2.5 適用于植物細胞壁研究(ynji)的拉曼光譜顯微技術傅立葉變換拉曼光譜分析技術( FTIR) 共振拉曼光譜技術( RRS) 表面增強拉曼光譜技術( SERS) 針尖(zhn jin)增強拉曼光譜技術（TERS）共聚焦顯微拉曼光譜技術( CRM)受激拉曼

25、散射光譜技術（SRS）相干反斯托克斯拉曼散射光譜技術（CARS）第二十二頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望第二十三頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望835cm-1:果膠多糖(du tn)1541cm-1,1650cm-1可能有細胞質蛋白1734cm-1，1240cm-1：木聚糖1629cm-1：非常復雜傅立葉變換拉曼光譜分析技術(jsh)( FTIR) 簡介第二十四頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望一個 MCF-7 細胞(xbo)的Micro-Raman ，以及隨后的定量分析 (A & B) Visible image

26、of an MCF-7 cell and chemical imaging specific for the intensity of CH stretching throughout the cell (80 80 pixels and a 0.5 mm spot size). (C) Hierarchical clustering of the spectral image specific for the fingerprint region (1800675 cm 1) displays the localities of sub-cellular components. Cluste

27、ring可以用來量化亞細胞成分，就像細胞核, 在這個細胞的例子里占了 12% (768 像素) Micro-Raman 簡介(jin ji)第二十五頁，共六十四頁。表面增強(zngqing)拉曼(SERS)簡介優勢：可以得到常規技術不易得到的信息什么是表面增強(zngqing)? SERS 效應是在激發區域內，由于樣品表面或近表面的電磁場的增強導致的拉曼散射信號極大的增強。怎么得到表面增強? 遠小于激發波長的金屬顆粒(Au, Ag)會使電磁場增強，增強的電磁場可以使在金屬顆粒表面的分子拉曼信號極大的增強 激光激發了金屬表面的等離子體目前吸附分子(fnz)產生表面增強拉曼散射的金屬有Ag、Au、

28、Cu、 Li 、Na 、K、In、 Al、Pt、 Rh、 Ni|、 Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等第二十六頁，共六十四頁。第二十七頁，共六十四頁。針尖增強拉曼光譜技術(jsh)（TERS）簡介掃描探針掃描探針(tn zhn)技術技術(SPM )第二十八頁，共六十四頁。第二十九頁，共六十四頁。第三十頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望相干拉曼散射顯微(xin wi)術（CARS&SRS）簡介CARS優勢：高靈敏度，高空間分辨率，高時間分辨率可以對脂類等小分子成像，重要的生命物質脂類進行觀察。（謝曉亮院士說，因為美國人比較胖，所以）可以通過選擇振動

29、光譜，對體內特定(tdng)小分子物質如藥物，或者生物大分子如核酸蛋白質進行無需標記的成像，是重要的活體成像手段可以進行視頻速率的活體監測可以很好的研究植物細胞壁中木質素的分布，有助于理解生物質轉換過程中的各種處理與反應的發生機理SRS優勢：比CARS更靈敏，且可以完成定量分析1999年，謝曉亮實驗室采用新的激光控制技術，使CARS顯微術走向實用2009年，謝曉亮實驗室開發出SRS顯微鏡，很大程度上彌補了CARS的不足第三十一頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望CARS與SRS技術的創立者謝曉亮，縱橫生命科學世界的華人(hu rn)美國國家科學院院士，哈佛大學終身教授，Na

30、ture雜志編委/research/faculty/sunney_xie.php第三十二頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望閔瑋，哥倫比亞大學教授。博后期間以第一(dy)作者發表有關SRS顯微技術第三十三頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望 CARS tissue image of small adipocytes of the subcutaneous layer from mouse ear tissue. The image was taken at a Raman shift of 2845 c

31、m-1 to address the CH2 stretching frequency.第三十四頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望RNAi screening of new fat storage regulatory genes based on in vivo lipid quantification using label-free SRS microscopy. SRS images at 2845 cm-1 for wild-type worm (a), the daf-2 mutant (b), and the transgenic worm intestin

32、ally overexpressing the lipase (c). (d) Quantification of fat content by SRS (n = 5 worms) and thin-layer chromatographygas chromatography. (e) SRS signal increase compared to the control for genes that resulted in a fat content increase of more than 25% when inactivated by RNAi (P 0.0001, n = 5 wor

33、ms).第三十五頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3 拉曼光譜在植物(zhw)細胞壁中的應用細胞壁成分很復雜，是一種納米復合材料，微纖絲嵌入在不同基體復合物中（纖維素，果膠，木質素），得到的光譜是多種物質光譜的重疊。植物的形狀和機械強度由植物細胞壁決定，而植物細胞壁是由結構組件在復雜組合而成。細胞壁必須能夠增長，因此,細胞壁具有靈活性和彈性。細胞壁的功能特性不僅取決于細胞壁的聚合物組成,還在于聚合物大分子結構和構象,和從幾納米尺度(即規模(gum)略高于分子)到幾微米高度有序的架構。而利用經典的化學技術來處理細胞壁聚合物會讓這些細節丟失。因此光譜方法發揮了重要作用檢查植物

34、細胞壁的原生狀態。不僅化學成分本身的利益,還構造和組成與細胞壁層以及不同聚合物的取向和變形的變化。關于細胞壁的主體結構的研究已經完成,在接下來的重點將次要的植物纖維以及更細小更細節的部分。第三十六頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望第三十七頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望第三十八頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.1微纖絲存在的技術難點：如果有合適的角度，拉曼光譜的強度取決于微纖絲之間的角度和激光偏振方向。改變激光偏振平行(0)垂直于纖維軸(90)會導致幾乎所有帶非常大的拉曼強度的變化，因此,在每一個植物細胞壁拉曼實驗中,纖維

35、方向(軸)和激光偏振調整在一個已知或者定義的角度。可以研究的內容：可以由于纖維取向的改變造成(zo chn)的強度變化,由此發生不同的纖維素含量次生細胞壁內的纖維素纖維與纖維軸變化之間的不同的壁層(S1-S2-S3),可以通過拉曼成像可視化觀察值得注意的纖維取向的變化往往對應于纖維素結晶度的變化第三十九頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.2細胞壁聚合物纖維素半纖維素較為(jio wi)復雜，而幸運的是木質素和果膠都有非常明顯的特征峰，因此可以利用拉曼光譜來研究。(圖示楊樹木材截面的拉曼圖像)第四十頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.3細胞壁分子(

36、fnz)的取向細胞壁組件(z jin)是高度有組織的，可以通過激光平行和垂直于纖維軸來驗證，而研究細胞壁分子的取向。R.H. Atalla and U.P. Agarwal, Science 227 (1985), 636638.第四十一頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.5力學(l xu)上的應用 監測分子壓力(yl)在分子水平上的力學壓力監測，給分子變形 Experiments on different cell wall types during deformation will help to deepen the micromechanical underst

37、anding of plant cell walls and its macromolecules. This technique can also give important insights into the micromechanics of other biomaterials, e.g. of spider silk and of newly created bioinspired composites. 識別和定位植物代謝產物 識別植物中的礦物質第四十二頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.6 細胞壁毒理植物的環境毒理方面。具有代表性的是Kamnev 等對植

38、物根際細菌的重金屬培養實驗, 研究表明細菌的細胞壁或膜積累(jli)重金屬可以引起其拉曼譜線的變化, 提示拉曼光譜技術在植物細胞壁環境毒理方面應用具有可能性Kamnev A A. Journal of Molecular Structure, 2002, 610( 1- 3) : 127- 131.第四十三頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望3.7 細胞壁無標記(bioj)成像第四十四頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望展望(zhnwng)12014.3.2 Nature Method哥倫比亞大學 prof.Wei Min(閔瑋) 將受激拉曼散射顯微鏡技

39、術，與一種小型但非常有活力的炔烴標記（即CC，碳碳三鍵）相結合，C = C是一種化合物鍵，當其拉伸時，會以獨特的“頻率”（不同于細胞內的自然分子）發出強烈的拉曼散射信號。活細胞 全程可視化跟蹤生命過程(guchng)SRS顯微鏡可捕獲小分子攜帶的CC鍵的獨特拉伸運動，生成活細胞和動物體內分子的三維圖像閔瑋說：“我們的新技術將開啟用其他方式難以實現的、針對活細胞和動物中一些生物小分子的許多研究。除了基礎研究，我們的技術還可能大大推動轉化應用。我相信SRS成像炔烴標記能夠像GFP熒光團熒光成像一樣，在大型物種中成像生物小分子。”第四十五頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望RRS

40、 可提供花青素糖基化修飾的典型光譜變化特征。這為次生產物(chnw)的酶代謝調控機制研究提供了手段, 植物次生代謝產物(chnw)定位的無損分析較多集中在植物器官水平。那么，甲基化，磷酸化修飾的光譜變化特征？能否用拉曼光譜技術觀察甲基化磷酸化？展望(zhnwng)2第四十六頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望謝謝謝謝(xi xie)(xi xie)！請多多指教！請多多指教！第四十七頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望細胞壁的結構成分1.纖維素 纖維素(cellulose)是植物細胞壁的主要成分，它是由1 00010 000個-D-葡萄糖殘基以-1,4-糖

41、苷鍵相連的無分支的長鏈。分子量在50 000400 000之間。纖維素內葡萄糖殘基間形成大量氫鍵，而相鄰分子間氫鍵使帶狀分子彼此平行地連在一起，這些纖維素分子鏈都具有相同的極性，排列成立體晶格狀，可稱為分子團，又叫微團(micellae)。微團組合成微纖絲(microfibril)，微纖絲又組成大纖絲(macrofibril)，因而纖維素的這種結構非常牢固，使細胞壁具有高強度和抗化學降解的能力。 存在于細胞壁中的纖維素是自然界中最豐富的多糖。據推算，每年地球上由綠色植物光合作用生產的纖維素可達1011t之多，而1990年全球糧食產量只有2.2109 t。如何把纖維素轉化成為人類可利用的食物或者

42、有效能源，是人們長期渴望解決的重大課題！2.半纖維素 半纖維素(hemicellulose)往往是指除纖維素和果膠物質以外的，溶于堿的細胞壁多糖類的總稱。半纖維素的結構比較復雜，它在化學結構上與纖維素沒有關系。不同來源的半纖維素，它們的成分也各不相同。有的由一種單糖縮合而成，如聚甘露糖和聚半乳糖。有的由幾種單糖縮合而成，如木聚糖、阿拉伯糖、半乳聚糖等。半纖維素在纖維素微纖絲的表面，它們之間雖彼此緊密連接，但并非以共價鍵的形式連接在一起。因此，它們覆蓋在微纖絲之外并通過氫鍵將微纖絲交聯成復雜的網格，形成細胞壁內高層次上的結構。3.果膠類 果膠物質(pectic substances)也是細胞壁的

43、組成成分。胞間層基本上是由果膠物質組成的，果膠使相鄰的細胞粘合在一起。果膠物質是由半乳糖醛酸組成的多聚體。根據其結合情況及理化性質，可分為三類：即果膠酸、果膠和原果膠。 (1)果膠酸 果膠酸(pectic acid)是由約100個半乳糖醛酸通過-1，4-鍵連接而成的直鏈。果膠酸是水溶性的，很容易與鈣起作用生成果膠酸鈣的凝膠。它主要存在于中層中。 (2)果膠 果膠(pectin)是半乳糖醛酸酯及少量半乳糖醛酸通過-1，4-糖苷鍵連接而成的長鏈高分子化合物，分子量在25 00050 000之間，每條鏈含200個以上的半乳糖醛酸殘基。果膠能溶于水，存在于中層和初生壁中，甚至存在于細胞質或液泡中。 (

44、3)原果膠 原果膠(protopectin)的分子量比果膠酸和果膠高，甲酯化程度介于二者之間，主要存在于初生壁中，不溶于水，在稀酸和原果膠酶的作用下轉變為可溶性的果膠。果膠物質分子間由于形成鈣橋而交聯成網狀結構。它們作為(zuwi)細胞間的中層起粘合作用，可允許水分子自由通過。果膠物質所形成的凝膠具有粘性和彈性。鈣橋增加，細胞壁襯質的流動性就降低；酯化程度增加，相應形成鈣橋的機會就減少，細胞壁的彈性就增加。4.木質素 木質素(lignin)不是多糖，是由苯基丙烷衍生物的單體所構成的聚合物，在木本植物成熟的木質部中，其含量達18%38%，主要分布于纖維、導管和管胞中。木質素可以增加細胞壁的抗壓強

45、度，正是細胞壁木質化的導管和管胞構成了木本植物堅硬的莖干，并作為水和無機鹽運輸的輸導組織。5.蛋白質與酶6.礦質 細胞壁的礦質元素中最重要的是鈣。據研究，壁中Ca2+濃度遠遠大于胞內，估計為10-510-4molL-1，所以細胞壁為植物細胞最大的鈣庫。鈣調素(calmodulin,CaM)在細胞壁中也被發現，如在小麥細胞壁中已檢測出水溶性及鹽溶性兩種鈣調素。第四十八頁，共六十四頁。激光器激光器如具有如具有30 nm，351 nm發射線的紫外激光發射線的紫外激光器；器；Ar激光器一般在激光器一般在488.0nm, 514.5nm等等可見區發光可見區發光(f un)；而；而Nd:YaG (釔鋁石榴

46、釔鋁石榴石石) )激光器則在激光器則在1064 nm的近紅外區使用。的近紅外區使用。試樣試樣(sh yn(sh yn) )室室發射發射(fsh)透鏡透鏡 使激光聚焦在樣品上使激光聚焦在樣品上收集透鏡收集透鏡 使拉曼光聚焦在單色儀的入射狹縫使拉曼光聚焦在單色儀的入射狹縫單色儀單色儀儀器心臟儀器心臟1個光柵，個光柵，2個狹縫個狹縫減少雜散收光減少雜散收光第四十九頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望2.4拉曼光譜技術在植物學研究(ynji)中的優勢1、水的拉曼散射強度很微弱,生物大分子處于水溶液中，因此拉曼光譜是研究水 溶液中的生物樣品和化學化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同時

47、覆蓋很廣波數的區間,可對有機物及無機物等多種物質進行分析。相反,若讓紅外光譜覆蓋如此廣闊的區域則必須改變各種器件的參數,相比較而言程序復雜不具有通用性。 3、拉曼光譜的譜峰清晰尖銳,適合定量研究以及(yj)運用差異分析進行定性研究。在化學結構分析中,獨立的拉曼區間的強度和功能集團的數量相關。 第五十頁，共六十四頁。生物生物(shngw)分子分子鑒定鑒定拉曼拉曼光譜光譜(gungp)法法對于對于蛋白蛋白質質中的酪中的酪胺酸可以胺酸可以測測出它是埋藏在出它是埋藏在內內或或暴露于暴露于外。如外。如果酪胺酸是被埋藏在果酪胺酸是被埋藏在內內部，部，則則它可做它可做為強為強的的氫氫鍵鍵供供給給者（即提供者

48、（即提供氫氫原子原子給給臨近臨近的的氫氫鍵鍵接受接受者）。此者）。此時時拉曼拉曼光譜光譜上上850cm-1/830cm-1的比值的比值為為0.5，即，即830cm-1的的光譜光譜峰峰較較高。高。反之，若酪胺酸反之，若酪胺酸暴露暴露在蛋白在蛋白質質外部，外部，則則比值比值將將升高，亦即升高，亦即850cm-1的的光譜光譜峰峰較較高。高。第五十一頁，共六十四頁。同同屬分子振(轉)動光譜異：紅外分子對紅外光的吸收強度由分子偶極距決定異：拉曼分子對激光的散射強度由分子極化率決定紅外：適用于研究不同原子的極性鍵振動 OH, CO，CX拉曼：適用于研究同原子的非極性鍵振動 NN, CC互補(h b)第五十

49、二頁，共六十四頁。同同屬分子振(轉)動光譜異：紅外分子對紅外光的吸收強度由分子偶極距決定異：拉曼分子對激光的散射強度由分子極化率決定紅外：適用于研究不同原子的極性鍵振動 OH, CO，CX拉曼：適用于研究同原子的非極性鍵振動 NN, CC互補(h b)第五十三頁，共六十四頁。O=C=O對稱伸縮O=C=O反對稱伸縮偶極距不變無紅外活性極化率變有拉曼活性極化率不變無拉曼活性偶極距變有紅外活性NoImage拉曼光譜(gungp)與紅外光譜(gungp)的關系第五十四頁，共六十四頁。互排法則：有對稱中心的分子互排法則：有對稱中心的分子(fnz)其分子其分子(fnz)振振動動 對紅外和拉曼之一有活性，則

50、另一非活性對紅外和拉曼之一有活性，則另一非活性互允法則：無對稱中心的分子互允法則：無對稱中心的分子(fnz)其分子其分子(fnz)振動振動對紅外和拉曼都是活性的。對紅外和拉曼都是活性的。第五十五頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望參考資料第五十六頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望第五十七頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望第五十八頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望Fig. 2 Raman images of the aerenchymatic parenchyma, sclerenchymaand a vasc

51、ular bundle at position 1 (P1) calculated byintegrating from 2,769 to 3,087 cm-1 (ac all cell wall polymers witha main part of cellulose), from 1,075 to 1,114 cm-1 (df changes incellulose orientation), from 842 to 872 cm-1 (gi pectin) and from1,641 to 1,546 cm-1 (jl lignin)第五十九頁，共六十四頁。拉曼光譜技術在植物細胞壁中的應用以及展望Fig. 3 Raman images of the squeezed parenchyma at position 3 (P3),the sclerenchyma and vascular bundle at positi