1、生殖支原體檢測方法的研究進展生殖支原體檢測方法的研究進展 論文論文關鍵字：技術 培養 方法 研究 引物 陽性 生長 檢測 標本 支原體自 Tully1等 1981 年首次從非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分離培養出 2 株生殖原體（Mycoplasma genitalun,Mg）以后，許多學者對 Mg 的生長特性、免疫學特性、分子生物學特性以及與疾病的關系等進行了大量的研究并建立了多種 Mg 的檢測方法，本文就 Mg 的檢測方法研究進展進行簡要綜述。1 分離培養法1.1 培養基培養1,2 Mg 對培養基要求極高且生長緩慢,培養較難,尤其是臨床標本中 Mg 的培養更不容易成功.Tully19

2、81 年建立了對醫學支原體具有重要意義的 SP-4 培養基.適合于 Mg 生長的 SP-4 培養基,不含醋酸鉈,含 Mg 代謝所需的葡萄糖及其它營養成份,最適 pH 為 7.4-7.5,可通過加入 0.8%Noble 瓊脂或0.50.6%瓊脂而固體化,用于克隆菌株,觀察菌落,Tully 等利用這種培養基,從 13份尿道分泌物標本中分離培養獲得 2 株 Mg,培養期約為 50 天.1996 年 Jensen 等還報道了另一種適合 Mg 生長的培養基，即改良 Friis 肉湯培養基，11 份 PCR檢測 Mg-DNA 陽性的尿道分泌物標本中，有 6 份在其中呈陽性生長。國內學者對 SP-4 培養基

3、進行了改良。趙季文等4利用改良的 SP-4 培基從性病及性亂人群中分離 Mg 獲得成功，初代生長時間在 30 天以上，平均為37.83 天，最長為 55 天。1.2 組織細胞培養法 組織細胞培養支原體，可為支原體提供良好的類似體內的生長環境。早在 60 年代，Chanock 等5報道了肺炎支原體（Mp）在組織細胞中的生長。90 年代，Jensen 等3，6開始嘗試用細胞培養法來進行 Mg 的繁殖，并借此在電鏡下觀察到 Mg 侵入細胞的過程以及在細胞內的定位。在 PCR的監測下，Jensec 發現在 11 分 PCR 檢測 MgDNA 陽性的尿道標本中，有 9 份適應在 Vero 細胞磁頭中增殖

4、，經過多次傳代培養后轉入改良的 Friis fF 肉湯培養基中，有 6 份能繼續傳代生長，最終在瓊脂培養基中克隆獲得 4 株。Jensen認為，在分離獲得新的 Mg 菌株方面，細胞培養繁殖過程起到了三方面的作用，一是使臨床標本中的 Mg 逐漸適應在人工培養基中生長，二是增加了接種于支原體肉湯培養基中的支原體數量，三是提供持續的接種源。2 血清學方法根據 Mg 的免疫學特性，人們建立了用檢測 Mg 抗體和檢測與鑒定 Mg 抗原的血清學方法。Furr 等7于 1984 年詳細報道了檢測 Mg 抗體的 MIF 技術。Moller 等對 31例未檢測出 Ct 和 Mh 血清抗體的急性盆腔炎患者，用 M

5、IF 檢測 Mg 抗體，發現其中大約 40%在發病后一個月內抗體滴度有 4 倍或 4 倍以上的改變。Taylor-Robinson 等9報道應用間接 MIF 檢測 NGU 患者 Mg 抗體，認為間接 MIF 試驗是一種具有足夠敏感性、特異性和簡便易行的檢測方法。Jensen 等曾用 EIA 檢測有尿道炎癥與無尿道炎癥狀的男性 STD 患者急性期血樣標本中 Mg 抗體，結果發現反應性較弱，且與 Mp 存在廣泛的交叉反應。根據特異性抗體能阻止支原體的生長及代謝這一特性，可采用已知高價血涉及進行祖先生長及代謝抑制試驗以鑒別支原體11。趙季文等曾采用 MIT 鑒定所分離獲得的 Mg 菌株。暴露于支原體

6、表面的脂結合膜蛋白（lipid-associated membraneproteins,LAMPs 是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其 LAMP 抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應12，13。）因此提取 Mg 的 LAMP 建立 ELISA 方法檢測 Mg 抗體，可消除 Mg 與 Mp 之間的交叉反應。3 分子生物學方法DNA 探針和聚合酶鏈反應（PCR）檢測 Mg 的方法，克服了前兩類檢測方法的弊端，為研究 Mg 與疾病的病因學關系提供了有力的手段。3.1DNA 探針技術 1987 年 Hyman14用 PUCB 載體構建成 Mg 基因文庫，并從中篩選

7、制備出特異性 DNA 探針，通過斑點雜交，可檢測僅含 0.1 ng 的特異性支原體 DNA，即 105CFU。3.2 聚合酶鏈反應（PCR）技術 PCR 是一種新的基因診斷技術，靈敏度高，特異性強，且快速、簡便。1990 年，PCR 技術開始在醫學支原領域應用。早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的 DNA 序列而設計。Palmer 等體外擴增 Mg 粘附蛋白的部分核苷酸序列，3 株 Mg 均出現 37bp 的 DNA 片斷，并證明 PCR 技術可檢測到 10-15g 的 mg-DNA，其引物序列的：mg1:5TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3mg2:5CTG CTT TG

8、G TCA AGA CAT CA31991 年 Jensen 等16根據 Mg 的粘附蛋白基因設計合成了如下組引物：mgPa-1 5AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3mgPa-1 5GAC CAT CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3mgPa-1 5CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3用 MgPa-1 和 MgPa-3 成功地擴增出 Mg 的 281bpDNA 片段，5 個臨床分離株擴增出同樣的產生，而其他支原體和細菌均為陰性，用 MgPa-2 作探針，對擴增產物經 Southern eP 印跡雜交，均為陽性，證明引物具

9、有特異性，共檢出下降大約有 50 個 Mg 細胞。1993 年 Jensen 等17又根據 Mg 粘膜蛋白基因設計了另一對引物，即：mg 粘附蛋白基因設計了另一對引物，即：mgPa-476：5ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3mgPa-903：5TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA TGC3用來證實和補充引物 MgPa-1 和 MgPa-3 所擴增的結果，其擴增片段為453bp。研究發現，這兩對 Mg 粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測 99 例尿道炎病人的尿道拭子，結果 17 例 Mg 陽性，而用培養法無一例陽性。1

10、994 年 Jensen18擴增 Mg 粘附蛋白基因序列并測序表明：該序列在 Mg條件之間有明顯異質性，為此，Jensen 等學者根據原體屬性高度保守區域16SrRNA 的基因序列，設計了種特異性 PCR 引物，以期檢測臨床標本中所有 Mg的感染：其引物序列為：Mg-1，5GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCTG3Mg-2，5ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT GGCT34 種臨床標本的實驗結果表明，Mg 粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN 基因序列則是 100%同源，將兩種引物 PCR 結合，還可在可疑陽性標本中檢測出 10-50

11、個 Mg 基因拷貝以下的 Mg 基因，即以 16SrRNA 基因為靶基因的PCR 系統在保證長期特異性基礎上更為靈敏。趙季文等19采用 Palmer 設計的引物，擴增 mg37bpDNA 片段，檢測三種人群的 Mg，結果是性亂人群陽性率為 25.26%，性病人群為 12.33%，而健康人群為 3.85%。孔繁榮等20采用 Jensen 設計的 MgPa-1 和 MgPa-3，擴增Mg281bpDNA 片段，檢測結果是性亂婦女 Mg 檢出率為 10.2%，STD 患者為 4.0%。1998 年，糜祖煌等2研究報道了分別以 Mg 粘附蛋白和 16rRNA 基因為靶基因建立的二種套式 PCR 檢測技

12、術，前者擴增生 Mg 的 374bpDNA 片段，后者擴增產生 241bpDNA 片段。套式 PCR 不僅提高了靈敏度，而且因采用兩對不同的引物，特性也進一步的得到提高。用這些法檢測 40 例女性 STD 患者，發現 Mg 陽性 12 例，陽性率 30%，檢出陽性率均高于普通 PCR 法。4 小結微生物感染診斷的“金標準”是培養法，然而 Mg 培養成功率極低，有待于對培養基進行進一步的研究和改良，以促進 Mg 在其中的生長；此外，將細胞株引入 Mg 的培養可能是一個較好的方法，有必要加強這方面的探索和研究。免疫學檢測方法因支原體種屬間易出現交叉反應以及對抗原、抗體純度要求較高而在實際應用上受到

13、一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測臨床標本中 Mg 抗原的方法，則具有較大的實用價值。PCR 技術是一個簡單而又直接的檢測 Mg 方法，正被日益廣泛地采用，主要用于 Mg 感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人群中 Mg 的流行病學研究。但在應用時應注意：臨床標本中 Mg含量低，DNA 純度不夠，抑制物過多，TaqDNA 聚合酶活性低均會引起假陰性，應進一步完善模板 DNA 的提取技術；因 PCR 靈敏度極高，在整個操作過程中均應嚴格避免 PCR 產物的污染，以減少假陽性。5 參考文獻Tully JG,D.Taylor-Robinson,RM,Cole,and DL Rose,A n

14、ewly discoveedmycoplasma in the human urogenital tract.Lancet ,1981,1288Tully JG,D Tylor-Robinson,DL Rose,et al.Mycoplasma genitalium,a newspecies from the human urogenital tract.IntJ.Syst .Bacteriol,1983,33(2):387Jensen JS,Hansen HT,Lind K,Isolation of Mycoplasm genitalium strainsfrom the male uret

15、hra.J Clin Microbiol,1996,34(2):286趙季文，王婉云，范寶劍，等。生殖支原體分離培養及流行病學意義的研究，南京鐵道醫學院學報，1997，16（4）：229Chanock RM,Fox HH,James WD,et al.Growth of laboratory and naturallyoccurring stuains of Eaton agent in monkey kidney tissue culture,ProSoc Exp Biol Med,1960,105:371Jensen JS,J Blom and K Lind,Intracellular l

16、ocation&nbs p;ofMycoplasma genitalium in cltured Vero cell as demon-strated byelectron microscopy,Int J Exp Path,1994,7591Furr PM and D Taylor-Robinson,Microm-munofluoresence technique fordetection of antibody to Mycoplasma genitalium. J ClinPathol,1984,37(9):1072Moller BR,D Taylor-Robinson ,and PM

17、Furr,Serological evidenceimplicating Mycoplasma genitalium inpelvic inflammatorydisease,Lancet,1984,1:1102Taylor-Robinson D,PM Furr ,and NF Hanna,Micro-biological andserological study of nongonococcal urethritis with special referenceto Mycoplasma genitalium.Genitourin Med,1985,61:319Jensec JS,R Qrs

18、um B Dohn,et al.Mycoplsma genitalium:a cause of maleurethritis?Genitourin,Med,1993,69:265中華醫學會微生物與免疫學會支原體學組，人體支原體感染的實驗診斷技術，1992 年 3 月Wang RY-H Shin JW-k: Grandinetti T,et al.High frequency of antibodiesto Mycoplasma penetrans in HIV infected patients.Lancet,1992,340:1312Wang RY-H,Grandinetti T,Tully

19、 J et al.Antibodies to M genitalium inpatients with AIDS and patients attending sexual transmitted diseasesclinics,Abstr93rd Gen Meet Am Soc Microbiol 1993,G-18:165Hyman HC,Yoger U,Razin S,et al.DNA probes for detection andidentification of Mycoplasma pneu-moniae and Mycoplasma genita lium.JClin Microbiol,1987,25(4):726Palmer HM,Giloy CB,Furr et al.Development and evaluat