1、基因工程各章知識點第一章緒論1. 基因工程的首例操作實驗三大理論基礎：DNA是遺傳物質、DNA的雙螺旋結構和半保留復制、遺傳密碼的破譯和遺傳物質傳遞方式的確定三大技術基礎：限制性核酸內切酶的發現與DNA的切割、DNA連接酶的發現與DNA片段的連接、基因工程載體的研究與應用基因工程的誕生：72年，P.Berg首次實現體外DNA重組：體外用EcoRI分別切割SV40和入DNA,并用T4DNA連接酶連接成為重組的雜種DNA分子73年，S.Cohen體外重組DNA并轉化：具Kanr的E.Coli質粒R65和具Tetr的E.Coli質粒pSC101切割并連接轉化的大腸桿菌具有雙重抗性S.Cohen和H.

2、Boyer首次實現真核基因在原核中表達：將非洲爪蟾的DNA與E.Coli質粒（pSC101）體外切割并連接，轉化大腸桿菌2. 基因工程的基本概念基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種新物體（受體）內，使之穩定遺傳并表達出新產物或具有新性狀的DNA體外操作技術，也稱為分子克隆或重組DNA技術。供體、載體、受體是基因工程的三大基本元件。3. 基因工程的基本操作過程a分離目的DNA片段：酶切、PCR擴增、化學合成等。b重組：體外連接的DNA和載體DNA，形成重組DNA分子。c轉化：將重組DNA分子導入受體細胞并與之一起增殖。d篩選：鑒定出獲得了重組DNA分子的

3、受體細胞。e對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產物。第二章載體1.理解用PBR322和PUC18作載體的克隆外源基因的原理。答案不確定PBR322作載體的克隆外源基因的原理：PBR322質粒具有12種限制性內切酶的單一識別位點：Tetr基因內有7個酶切位點：BamHI,Sall:Amp基因內有3個酶切位點：PstI。EcoRI和Hindm不在抗生素基因內，不導致插入失活。如果在pBR322質粒的Tetr基因內位上插入外源DNA片斷，將切斷了tetr基因編碼序列的連續性，使tetr失去活性，產生出AmprTets表型的重組pBR322質粒，轉化入AmpsTe

4、ts的大腸桿菌細胞。先涂布在含氨節青霉素的選擇培養基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們影印于含四環素的選擇性培養基上。插入外源片斷的重組質粒不能在這種培養基上生長，這樣就找出了含重組質粒的大腸桿菌。如果在pBR322質粒的Ampr基因內位點插入外源DNA片斷，則反之。PUC18作載體的克隆外源基因的原理：在pBR322的基礎上，在其5'-端帶有一段多克隆位點的lacZ'基因，而發展的具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。典型的pUC系列的質粒載體包括如下4個組成部分：a、pBR322的復制起始點。b、氨節青霉素抗性基因但它的DNA核昔酸序列已經發生了變化，不再含有原來的核酸內切

5、限制酶的識別位點。c、大腸桿菌3-半乳糖昔酶基因（lacZ）的啟動子及編碼a-肽鏈的DNA序列，此結構稱之為lacZ'基因。d、位于lacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點（MCS）區段。但它并不破壞該基因的功能。2. 理想載體的必備條件（1）、較小的分子量和較高的拷貝數。（2）、應最大限度的具有各種常用限制性內切酶的單一酶切位點。（3）、具兩種以上的選擇標記基因。（4）、重組質粒較易導入宿主細胞并復制和表達。3.穿梭載體和a-互補A穿梭質粒載體是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的宿主細胞中存活和復制的質粒載體。常見的穿梭質粒有大

6、腸桿菌-土壤農桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-枯草芽跑桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體。BlacZ基因的突變體M15質粒（缺失氨基酸殘基11到41）是沒有野生型lacZ基因產物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入6-半乳糖昔酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段（a肽）則能恢復M15分解X-gal，而顯示藍色的能力。這樣一種基因內互補現象稱做a互補。第三章核酸操作的基本技術1.堿解法提取質粒DNA的原理？提取DNA時常用試劑的作用原理堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再將pH值調至中性使其復性，復性的為質粒DNA，而染色體

7、DNA不會復性，纏結成網狀物質，通過離心除去。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離,當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。常用試劑的作用溶菌

8、酶：溶解菌體細胞壁的6-1,4糖苜鍵，即具溶菌作用。葡萄糖：增加溶液粘度，防止DNAe機械切力作用而降解EDTA金屆離子螯合劑，抑制脫氧核糖核酸酶（Dnase）對DNA勺降解作用SDS陰離子表面活性劑，可破壞細胞膜，使DNAI放出來，結合蛋白質，使蛋白質沉淀下來抑制脫氧核糖核酸酶（RNase）的活性。酚、氯仿：蛋白質變性劑。使蛋白質失水變性，；離心后與水相（含DNA）分離。異戊醇：降低分子表面張力，可減少氣泡的產生；有助于分相。無水乙醇：DNA的沉淀劑。奪取DNA周圍的水分，使DNA失水而易于聚合。NaOH:核酸在pH=59的溶液中穩定，pH>12或pH<3時會引起氫鍵斷裂。KAc

9、:KAc-HAc,pH=4.8緩沖液，變性的質粒DNA在此溶液中發生復性。2. RNA分離的關鍵因素。（RNA酶是一種蛋白質，所以提取時利用氯仿抽提可以很好去除，得到高質量的RNA。）RNA分離的關鍵因素是盡量減少RNA酶（RNase）的污染，因此在RNA制備過程中，必須注意控制RNase酶的活性，并設法抑制其活性。造成RNase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、實驗人員的手及飛沫。玻璃器皿：烘箱中（180C）烘烤8h以上。塑料器皿：0.1%DEPC（diethylpyrocarbonate，二乙基焦碳酸鹽）浸泡或用氯仿洗滌。配置的溶液應盡可能用0.1%DEPC在37C處理12h以上，然后高

10、壓滅菌。全部實驗過程均需戴手套操作，并經常更換。RNA電泳槽常用去污劑洗滌，0.1%DEPC處理。提取中出現RNA降解原因：操作過程中溫度太高、操作時有RNA酶的污染或RNase抑制劑量不足等都有可能使RNA降解。解決方法：做好使用器皿的RNase去除工作；在整個操作過程中最好在低溫（4C）或是冰上進行；操作者自始至終戴手套。3. 電泳法和紫外分光光度法都能檢測DNA的濃度和純度，哪種方法更好。A、紫外光度法原理：核酸中含有喋吟和嚅嚏環，在256265nm處顯示出特征吸收峰，在230nm處吸收最小。DNA或RNA分子在260nm處有特異吸收峰，吸收強度與系統中DNA或RNA的濃度成正比。方法：

11、首先用TE或ddH2O稀釋待測DNA樣品；用TE或ddH2O為空白對照，在260nm及280nm處調節紫外分光光度計讀數為0;加入DNA稀釋液與上述兩波長處讀取OD值；A260值為1時相當于50ug/mL的dsDNA,40ug/mL的ssDNA或RNA;通過計算公式計算濃度及純度。雙鏈DNA（dsDNA）濃度（g/ml）=50XOD260X稀釋倍數單鏈DNA或RNA（ssDNAssRNA）濃度g/ml）=40XOD260X稀釋倍數DNA純度可通過OD260/OD280來衡量：純的DNA的OD260/OD280為1.82.0;OD260/OD280>2.0為RNA污染，V1.8為蛋白質污染

12、；OD260/OD280V0.9時適當稀釋樣品，可再進行一次抽提；OD260/OD280>2時則RNA過高，要除去RNA。B、水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA在生理條件下，核酸分子是多聚陰離子當核酸分子被放置在電場當中時，它們就會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。原理：在瓊脂糖凝膠中加入EB,當與DNA混合時EB可插入到DNA分子中形成熒光絡合物。而EB在紫外光照射下能發射熒光，熒光的強度與DNA的含量成正比。便可十分敏感而方便地檢測出凝膠介質中DNA的存在、強度和譜帶的位置。在適當的染色條件下，熒光的強度同DNA數量成正比，

13、據此，人們可以估計DNA的濃度。不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速度不同，據此，科研工作者們便能判斷DNA的分子質量，其有無降解；同時，通過同已知分子質量的標準DNA片段之間的比較，還可測定出隨遷移的DNA片段的分子質量。4.為什么核酸保存在TE溶液(Tris-HCl和EDTA)中比較穩定在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(pKa=7.2)和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應時，不同的酶對

14、輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-Hcl(pKa=8.0)的緩沖系統，由丁緩沖液是TrisH/Tris，不存在金屆離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCL系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。第四章限制性內切酶1. 寄主的限制與修飾的作用R/M中的限制作用(restriction)是指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA(外源DNA)導致噬菌體寄主幅度受到限制的現象。限制酶來完成R/M中的修飾作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通過甲基化作用得以甲基化，使DN

15、A獲得修飾，從而避免遭自身限制酶的破壞。寄主的限制與修飾有兩個方面的作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。細菌正是利用限制與修飾系統來區分自身DNA與外源DNA的。2.RE識別序列的特點主要類型I型型m型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源三聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列TGAN8TGCT或AACN6GTGC旋轉對稱序列GAGCC或CAGCAG切割位點距離識別位點1Kb處隨機性切割識別序列內或附近特異性切割距識別序列下游2426bp處3. 同裂酶同尾酶完全消化不完全消化星號活性同裂酶(isoschizom

16、ers)：來自不同有機體，識別切割相同序列的一組酶。同尾酶(isocaudamer):來源不同，識別序列也各不相同，但能產生出相同的粘性末端的RE。由同尾酶所產生的DNA片段可通過粘性末端之間的互補作用而連接，在基因克隆中很有用。完全酶切消化(completedisestion):如果一種RE對某個DNA分子的所有識別位點均實現了完全的切割，稱為完全酶切消化。限制性內切酶的不完全消化(partialdigestion):RE對DNA分子的消化不完全，即未能在所有分子的所有識別位點進行完全的切割，可獲得分子量大小有所增加的限制片段產物。星號活性：非最適條件（酶量大、甘油高、低離子強度，高pH等）

17、常使酶發生不正確切割（切割特異性序列相似的序列）。4. 影響酶切的因素（1）、DNA純度：DNA制劑中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高鹽濃度等，影響RE的活性。提高酶切效率方法：增加RE用量；擴大反應體積以使潛在的抑制因素相應稀釋；延長酶切時間。（2）、DNA甲基化程度：甲基化作用會強烈影響酶活性；基因工程中用的菌株為喪失了甲基化酶的；不同位點之間的甲基化程度是不相同的且與DNA來源的細胞類型有密切關系。（3）、酶切反映溫度：（4）、DNA分子結構：超螺旋比線性DNA需酶量大；DNA的邊側序列也有影響。（5）、RE的緩沖液：Mg2+。Tris-HCl:使pH處于最佳數值范圍內。保護酶穩定

18、性的物質3-疏基乙醇、（DDT）、（BSA）。第五章DNA的連接1. 連接酶的作用及范圍作用：連接酶是一種能夠催化DNA上裂口兩側（相鄰）核昔酸裸露的3'羥基和5'磷酸之間形成共價結合的磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA裂口重新連接起來的酶。在DNA復制、修復以及重組過程中起重要作用。范圍：可連接切口（nick），但不可連接缺口（gap）。可連接雙鏈DNA分子的一部分，但不可連接兩條單鏈DNA分子或環化的單鏈DNA分子。DNA連接酶的種類：1、T4噬菌體DNA連接酶：T4噬菌體DNA連接酶（又稱T4DNA連接酶）分子質量為68Ku,需要ATP作為輔助因子，最早是從T4噬菌體感染的大

19、腸桿菌中提取的。范圍T4噬菌體DNA連接酶可以連接：（1）兩個帶有互補黏性末端的雙鏈DNA分子。（2）兩個帶有平頭末端的雙鏈DNA分子。（3）一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子。（4）RNA:DNA雜合體中RNA鏈上的切口，也可將RNA末端與DNA鏈連接。2、大腸桿菌DNA連接酶：大腸桿菌DNA連接酶分子質量為75Ku,需要NAD+作輔助因子。范圍大腸桿菌DNA連接酶可連接：（1）兩個帶有互補黏性末端的雙鏈DNA分子。（2）一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子。2. 影響連接的因素A、影響因素：反應溫度、離子濃度、DNA末端的結構、DNA末端的相對濃度、DNA片段的濃度和相對分子量等對連接效率都有影響。

20、連接反應速度完全由互相匹配的DNA末端濃度所決定。在連接反應體系中，一般可形成兩種不同構型的DNA分子：線性分子；環狀分子。在基因克隆操作技術中，DNA分子的構型直接影響轉化過程。對于兩個以上的DNA分子的連接，不僅要考慮反應體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上，應該保證一個DNA分子的未端具有較高的幾率與另一個DNA分子連接，以減少自連，從而達到重組的目的DNA分子間的連接。B、提高連接效率的方法：a適宜的溫度：為粘性末端的Tm與DNA連接酶最適溫度的折衷。b插入片段載體片段10-20倍。c適當加大酶的用量，但單位含酶量低時，隨著用量的加大，甘油含量也

21、提高了，反而影響連接效率。d用堿性磷酸酶處理載體，使5'-P變為5'-OH,減少載體自連，提高重組分子形成比率。3. 平齊末端的連接方法A、直接用T4連接酶連接B、同聚物加尾法：不需模板鏈的存在，末端脫氧核昔酸轉移酶可將核昔酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3'-OH上。故在反應物中存在一種脫氧核昔酸的條件下，便構成由同一種類型核昔酸組成的多聚核昔酸尾巴，當兩種DNA分子帶有可互補配對的poly尾巴時，能彼此連接起來，此種連接方式稱為同聚物加尾（一般加10-40個堿基就足夠了）。應用（1）、酶切后形成的平齊末端。（2）、機械切割大分子DNA產生平齊末端。（3）、RNA:cD

22、NA具有平齊末端。缺點：無法在尾巴處（原位）再進行切割。C、銜接物連接法：所謂銜接物（linker）是指用化學方法合成的一段由10-12個核昔酸組成具有一個或數個限制酶識別位點的平齊末端的雙鏈寡聚核昔酸片段。將銜接物的5'末端和待克隆的DNA的5'末端用多核昔酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4連接酶的作用將兩者連接起來。接著用適當的RE消化具有銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者產生出了的互補的粘性末端，則可用連接酶將DNA分子和載體分子按常規的粘性末端連接法將二者連接起來。優點：兼具同聚加尾法和粘性末端法各自的優點；可以根據實驗需要設計不同RE識別位點的銜接物，

23、從而大提高平齊末端DNA片段的連接效率；可實現外源片段定向克隆。缺點：基因內部有相同酶位點時，酶切會把該基因切斷，從而給后續的亞克隆和其他操作帶來麻煩。»接頭連接法第六章轉化及重組體的鑒定1. 感受態感受態：凡是能吸收游離DNA片段的細菌稱為感受態細菌或者說處于感受態；正常生長條件下的一個或多個不同生長時期都處于高度感受態的細菌；經過特殊處理才表現感受態；對于轉化表現強烈抑制的細菌。2. 在DNA水平上檢測轉化體的方法有哪些；RNA水平的檢測方法。答案不確宇DNA水平上質粒DNA的提取和限制性酶切分析；質粒DNA與分子雜交。觀察是否有表型變化的重組體。聯合運用直接和間接的手段進行快速

24、而準確的鑒定。重組體的篩選：直接選擇法：抗藥性標記選擇，插入失活法；標志補救如a互補；分子雜交法原位雜交；Southern印跡。非直接選擇法：免疫學方法如免疫化學方法酶免檢測法。第七章目的基因的獲得1. 什么是cNA?如何通過構建cNA文庫和基因組文庫獲得目的基因cDNA(complementaryDNA):是指與mRNA互補的DNA，是由mRNA通過反轉錄酶進行反轉錄而成的。cDNA文庫的構建基本過程：通過一系列的酶促作用，使總poly(A)mRNA制劑轉變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當的載體cDNA基因文庫含重組DNA分子的受分子上，然后再轉化給大腸桿菌寄主菌株的細胞內。如此便構成了包含

25、產所有基因編碼的(cDNAlibrary)。|mRNA|反轉錄酶|cDNA|復制版鏈cDNA|載體|重組DNA分子|受體菌具體步驟第一步：分離總RNA，然后從總RNA中分離出mRNA部分，約占細胞總RNA的1%-2%。第二步：以mRNA為模板，經過逆轉錄合成第一條cDNA。第三步：將mRNA-cDNA雜交分子轉變為雙鏈cDNA分子。第四步：將合成的雙鏈cDNA重組到質粒載體或噬菌體上。第五步：將重組分子轉入大腸桿菌主細胞中進行增殖。應用入噬菌體構建基因組文庫：1、基本步驟：從供體基因組DNA產生適當大小的DNA片段；在體外將這些DNA片段同適當的入噬菌體連接成重組分子；轉化到大腸桿菌的受體細胞

26、中去；從轉化子克隆群體中挑選出含有目的基因的片段。2. 供體DNA制備：(1) 、機械切割產生合適大小的外源DNA片段。(2) 、RE的部分消化產生合適大小的外源DNA片段。從基因組DNA文庫獲取目的基因：組織或細胞染色體DNA限制性內切酶基因片段克隆載體回DNA分子|受體菌橢重組分子的轉化2.PCR的原理；引物；簡并引物；RT-PCR;PCR的原理：實質為體內DNA復制的體外模擬。當雙鏈DNA變性為單鏈后，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，并利用反應混合物中的四種dNTPs,以與模板互補的核昔酸為引物，合成新生的DNA互補鏈。理想拷貝數=2n,(n：循環次數)；實際拷貝數=(1+x)n,(X：

27、平均效率約為0.85,n：循環次數)9引物定義：是(兩條)人工合成的與模板DNA£補的核苜酸鏈長度：一般為15-30bp,且與單鏈DN模板互補，短的6-12bp,長的35bp。兩引物與模板結合位點之間的距離決定了擴增區段的長度，1kb為理想的擴增跨度，2kb左右為有效擴增跨度。簡并引物：簡并引物是由多種寡核苜酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數個核苜酸的差異。RT-PCR先將RN敏錄成cDNA接著以cDN的棋板進行PCIT增。這一技術稱為反轉錄PCR(reversetranscriptionPCRRT-PCR)。3. 設計簡單的引物；如何通過PCR獲得目的基因給出DNA序列，寫出引物

28、第八章凝膠電泳與分子雜交1.如何通過瓊脂糖凝膠檢測DNA(電泳的原理及影響因素)電泳原理在生理條件下，核酸分子是多聚陰離子當核酸分子被放置在電場當中時，它們就會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNAb子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強；反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。瓊脂糖凝膠電泳(agrosegelelectrophisis)(1) 支持介質：瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的。(2) 分辨能力：瓊脂糖凝膠基質的孔徑大小可以通過調整瓊脂糖的濃度來改變

29、。其分辨力為為0.250kb范圍之間的DNAt段；凝膠濃度越大，介質孔徑越小，分辨能力越強。影響DNAfc泳的因素DN疥子大小、DN疥子構型、凝膠濃度、電場強度、EB電泳緩沖液2. Southern雜交；缺口平移法制備探針Southern雜交：根據毛細管作用的原理，使在電泳中分離的DN后段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNAJRN徐針的雜交作用檢測這些被轉移的DN后段，這種實驗方法叫做DNAP跡雜交技術。由于它是由E.Southern于197弭首先設計出來的，故乂叫做SouthernDNA印跡轉移技術。缺口平移法制備探針：首先用適當濃度的DNA酶I(DNAseI)在探針DNA雙

30、鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶I(DNapolymerasI)的53,的外切酶活性，切去帶有5'磷酸的核昔酸；同時又利用該酶的5'3,聚酶活性，使32P標記的互補核昔酸補入缺口，DNA聚合酶I的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3'的方向移動，同時DNA鏈上的核昔酸不斷為32P標記的核昔酸所取代。3. 什么是Northern雜交和western雜交Northern雜交：將變性(用甲醛、乙二醇，防止RN形成二級結構)瓊脂糖膠電泳分離的RNA或mRNA轉移吸印到特殊(疊氮化的或其它化學修飾的)的活性濾膜或濾紙上，通過共價交聯作用而使它們永久地結合在一起，與標記的探針

31、RN威DN厥交，然后放射自顯影以分析RNA(大小、數量)的方法，這種方法同薩瑟恩的DNAP跡雜交技術十分類似，所以叫做諾塞恩RNA吸印雜交技術（Northernblotting）。western雜交:將蛋白質從電泳凝膠中轉移并結合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應，以檢測蛋白質的雜交技術，這種技術叫做韋斯頓蛋白質雜交技術（Westernblotting）。第九章測序Sanger測序的原理（2分題）利用DN原合酶和雙脫氧鏈終止物測定核苜酸順序的方法。也稱為引物合成法或酶催引物合成法。原理：DN>e合酶能利用單鏈DN的棋板，離體合成出其互補鏈，當反應液

32、中存在23'-雙脫氧核苜三磷酸（ddNTB,它可以象2'-脫氧核苜三磷酸（dNTP那樣直接摻入新合成的DN側中，但因ddNTP3'端不具-OHtt團，所以寡核苜酸鏈就不能再繼續延長了即DNA1合成中止了。第十章植物基因工程1.反義核酸Ti質粒GFP反義核酸是指能與特定mRNA精確互補、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達，使之低表達或不表達，這種技術即為反義核酸技術。Ti質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環狀DN疥子,其分子量為95156X106D,約有200kb左右。具有接合轉移特性GFP（綠色熒光蛋白基因）：這種蛋

33、白質最早是由下村修等人在1962年在一種學名Aequoreavictoria的水母中發現。其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色螢光。這個發光的過程中還需要冷光蛋白質Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質與鈣離子（Ca2+）可產生交互作用。2. Ti質粒的改造應掌握以下幾個原則：a、保留TDNA勺轉移功能和vir區。b、除去TDNA勺致瘤性（激素基因）。c、通過簡便手段使外源DN®入TDNA,并可隨之整合到植物染色體上。3. 農桿菌轉化的原理農桿菌共培養法最早是由Marton等（1979年）以原生質體為受體建立起來的，經過一系列改進后，目前已經成為最常用的轉化方法。共培養法是利用Ti質粒系統，將農桿菌與植物原生質體、懸浮培養細胞、葉盤、莖段等共同培養的一種轉化方法。轉化過程：再生體系的建立轉化共培養法