1、水中細菌總數和大腸菌群的檢測(一) 實驗目的(1) 了解和學習水中細菌總數和大腸菌群的測定原理和測定意義。(2) 學習和掌握用稀釋平板計數法測定水中細菌總數的方法。學習和掌握水中大腸菌群的檢測方法。(二) 實驗原理水是微生物廣泛分布的天然環境。各種天然水中常含有一定數量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。水的微生物學的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水標準規定，飲用水中大腸菌

2、群數每升中不超過3個，細菌總數每mL不超過100個。所謂細菌總數是指1mL或1g檢樣中所含細菌菌落的總數，所用的方法是稀釋平板計數法，由于計算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit,cfu)數，故其單位應是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數量。所謂大腸菌群，是指在37C24h內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個屆內的細菌組成，即埃希氏桿菌屆、檸檬酸桿菌屆、克雷伯氏菌屆和腸桿菌屆。水的大腸菌群數是指100mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭

3、氧芽胞桿菌等多種細菌。這些細菌都可隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內數量最多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群的存在是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質較多、易于阻塞濾孔的水樣。（三）實驗器材（1）菌落總數的測定：1）培養基：牛肉膏蛋白月東瓊脂培養基，無菌生理鹽水。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平血，滅菌吸管，滅菌試管等。（

4、2）大腸菌群的測定；1）培養基： 乳糖膽鹽蛋白月東培養基：蛋白月東20g，豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g，乳糖10g,0.04%漠甲酚紫水溶液25mL，水1000mL,pH7.4。制法：將蛋白月東、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH,加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL,，并倒置放入一個杜氏小管，115C滅菌15min。雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白月東培養基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。 伊紅美藍瓊脂培養基：蛋白月東10g，乳糖10g,K2HP042g,2%伊紅水溶液20M1,0.65%美藍水溶液lOmL，瓊脂17g，水1000mL,pH7.1。制法：將蛋白月東、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后

5、分裝.121C滅菌15min備用。臨用時加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55C,加入伊紅和美藍溶液，搖勻,傾注平板。 乳糖發酵管：除不加膽鹽外.其余同乳糖膽鹽蛋白月東培養基。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平血，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實驗方法（1）水樣的采集：1）自來水：先將自來水龍頭用灑精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min,以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2）池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內檢測

6、的，需放入冰箱中保存0細菌總數的測定：1）水樣稀釋及培養： 按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋：根據對水樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度（飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較活潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水一被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度），吸取1mL稀釋液于滅菌平血內，每個稀釋度作3個重復。 將熔化后保溫度45C的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養基倒平也，每皿約15mL,并趁熱轉動平皿混合均勻。 待瓊脂凝固后，將平也倒置于37C培養箱內培養241h后取出，計算平也內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得1

7、mL水樣中所含的細菌菌落總數。2）計算方法：作平板計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數。3）計數的報告： 平板菌落數的選擇：選取菌落數在30-300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個重復時，應選取兩個平板的平均數。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板計數作為該稀釋度的菌數。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布乂很均勻，可計算半個平板后乘2以代表整個平板的菌落數。 稀釋度的選擇：a. 應選擇平均菌落數在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數報告之（表1例1）。b.

8、 若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應報告其平均數；若比值大于2,則報告其中較小的數字（1例2、例3）。c. 若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（1例4）。d. 若所有稀釋度的平均菌落數均小丁30、則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（1例5）。e. 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小丁1乘以最低稀釋倍數報告之（表1例6）。f. 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數乘以該稀釋倍數報告之（表l例7）。 細菌總數的報告：細菌的菌落數在1

9、00以內時，按其實有數報告；大丁100時，用二位有效數字，在二位有效數字后面的數字，以四舍五入方法修約。為了縮短數字后面的0的個數，可用10的指數來表示，如表1報告方式一欄所小。（3）大腸菌群的測定（多林:酵法）：表1稀釋度的選擇及細菌數報告方式稀釋度及鑿落數兩稀釋鑿落總數/（cfu/g報告月式（菌落總數）10-110-210-3度之比或cfu/mL)/(cfu/mL或cfu/g)1多不可計16420-1640016000或1.6x1042多不可計295461.63775038000或3.8x1043多不可計271602.22710027000或2.7X1044多不可計多不可計313-3130

10、00310000或3.1X105527115-270270或6000-V10V107多不可計30512-3050031000或3.1X1041）生活飲用水或食品生產用水的檢驗： 初步發酵試驗：在2個各裝有50mL的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白月東培養液（可稱為三倍乳糖膽鹽）的三角瓶中（內有倒置杜氏小管），以無菌操作各加水樣100mL。在10支裝有5mL的三倍乳糖膽鹽的發酵試管中（內有倒置小管），以無菌操作各加入水樣10mL。如果飲用水的大腸菌群數變異不大，也可以接種3份100mL水樣。搖勻后，37C培養24h。 平板分離：經24h培養后，將產酸產氣及只產酸的發酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板

11、（EMB培養基）上，37C培養1824h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屆光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同類型菌落13個，37C培養24h,如果產酸乂產氣者，即證實有大腸菌群存在。 報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管數，查表107-2（或表107-3），報告每升水樣中的大腸菌群數（MPN）。2）水源水的檢驗：用于檢驗的水樣量，應根據預計水源水的污染程度選用下列各量。 嚴重污染水

12、：1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。 中度污染水：10.1,0.1,0.01mL各1份。 輕度污染水：100,10,1,0.1mL各l份。 大腸菌群變異不大的水源水：10mLl0份。表2大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數0230表3大腸困群數變異不大的飲用水陽性管數0123接種水樣總量每升水樣中大腸菌群數v341118300mL(3份100mL)表4大腸菌群檢索表（嚴重污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注10.10.010.001大腸菌群數-v900-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900接種水樣總-+-2200量為1.111+-2300(

13、1,0.1,-+28000.01,+-+92000.001mL+-+-9400各一份）+-+18000+-23000+-+96000+-238000+238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中大腸菌群數備注1010.10.01-v90-+90-+-90-+-95-+180-+-+190接種水樣總-+-220量為11.11+-230(10,1,-+2800.1,0.01+-+920mL各一+-+-940份）+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注1001010.1大腸菌群數-v9-

14、+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19接種水樣總-+-22量為111.1+-23(100,10,-+281,0.1mL+-+92各一份）+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7大腸菌群變異不大的水源水陽性管數012345678910每升水樣中V10112236516992120160230大腸菌群數230備注接種水樣總量100mL（10mL10份）操作步驟同生活用水或食品生產用水的檢驗。同時應注意，接種量1mL及1mL以內用單倍乳糖膽鹽發酵管；接種量在1mL以上者，應保證接種后發酵管（瓶）中的總液體量為單倍培養液量。然后根據證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）

15、數，查表107-4、表107-5、表107-6或表107-7,報告每升水樣中的大腸菌群數（MPN）。附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經過抽濾，細菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼丁大腸菌群選擇性培養基上進行培養。再鑒定濾膜上生長的大腸菌群的菌落，計算出每升水樣中含有的大腸菌群數（MPN）。（1）準備工作：1）濾膜滅菌：將3號濾膜放入燒杯中，加入蒸僻水，置丁沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2）濾器滅菌：準備容量為500mL的濾器，用點燃的灑精棉球火焰滅菌，也可用121C高壓滅菌20min。3）培養:3）培養：將品紅業硫酸鈉培養基放入37C培養箱內預溫30-60min。（2）過濾水樣：1）用無菌鑲子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333mL注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在一50kPa壓力下進行抽濾。2）水樣濾完后再抽氣約5s,關上濾器閥門，取下濾器，用無菌鑲子夾取濾膜邊緣部分，