1、2.2 動物細胞工程 動物細胞融合技術與單克隆抗體新教材人教版選擇性必修三【教學過程】Teaching Process1.概念圖3.教學總結、綜合2.課堂教 學內容4.課堂練習鞏固典型習題規律總結單克隆抗體建立模型動物細胞融合 人體血液中的樹突狀細胞是一種具有很強的抗原呈遞功能的淋巴細胞。近年來的研究發現，樹突狀細胞與腫瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞，既能表達腫瘤抗原，又能合成激活T細胞的相關刺激分子。用此方法制成的腫瘤疫苗可以誘導機體產生較強的特異性免疫反應，這為癌癥的治療提供了新的方法。討論： 1.但如何才能讓兩個不同的細胞融合? 2.細胞融合技術在生產實踐中有哪些應用? 到社會中去時間成果1

2、9世紀30年代觀察到肺結核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中有多核細胞1858年觀察到正常組織、發炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現象。1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發生融合的過程。1876年在無脊椎動物中發現了細胞合并現象。1962年日本學者岡田發現仙臺病毒具有觸發動物細胞融合的效應。1965年英國科學家證實了滅活的病毒可誘發動物細胞融合1974年華裔加拿大學者高國楠創立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌穩定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代發展出了電融合技術(1985年酵母

3、原生質體電融合)動物細胞融合技術的發展歷史2.動物細胞融合一.動物細胞工程19世紀30年代，科學家曾在惠肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現象?旁欄思考P49病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。2.動物細胞融合一.動物細胞工程（1）動物細胞融合技術：指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術誘導原生質體融合 物理方法：電融合法、離心法 化學方法：聚乙二醇融合法、 高Ca2+-高pH融合法（2）原理：細胞膜具有流動性 誘導動物細胞融合 物理方法：電融合法 化學方法：聚乙二醇（PEG）融合法 生物方法：滅活的病毒誘導法2.動物細胞融合一.動物細胞工

4、程正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞（2）原理：細胞膜具有流動性 2.動物細胞融合一.動物細胞工程19651965年，研究證實了滅活的病毒在適當條件下確實可以誘導動物細胞融合。年，研究證實了滅活的病毒在適當條件下確實可以誘導動物細胞融合。2.動物細胞融合一.動物細胞工程病毒的滅活 ：滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結構。紫外線紫外線滅活滅活滅活病毒誘導細胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。2.動物細胞融合一.動物細胞

5、工程（3）過程兩親本細胞的細兩親本細胞的細胞核逐漸融合胞核逐漸融合病毒吸附在細胞表病毒吸附在細胞表面并使細胞凝集面并使細胞凝集兩親本細胞膜上兩親本細胞膜上磷脂和蛋白質重磷脂和蛋白質重新排布形成通道新排布形成通道通道擴大，病通道擴大，病毒流入細胞質毒流入細胞質滅活的病毒誘導細胞融合的過程示意圖滅活的病毒誘導細胞融合的過程示意圖2.動物細胞融合一.動物細胞工程動物細胞A動物細胞B雜交細胞AB誘導、融合、篩選誘導、融合、篩選膜融合膜融合 質融合質融合核融合核融合雜種細胞經第一次有絲分裂兩個核才融合雜種細胞經第一次有絲分裂兩個核才融合細胞融合完成的標志細胞融合完成的標志: :細胞核融合成一個核細胞核融

6、合成一個核（3）過程2.動物細胞融合一.動物細胞工程(4)動物細胞融合結果：形成單核細胞，具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息，可表現出兩個或多個親本的特點。思考：誘導融合后的細胞一定具有雙方的遺傳信息嗎？為什么？不一定，誘導A、B兩種細胞融合，融合后可能有A、B未融合細胞及AA、AB、BB等多種細胞，因此細胞融合后需要進行篩選。2.動物細胞融合一.動物細胞工程突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。利用細胞融合技術而發展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。 (5)意義：2.動物細胞融合一.動物細胞工程植物體細胞雜交和

7、動物細胞融合的比較2.動物細胞融合一.動物細胞工程動物細胞融合過程植物體細胞雜交過程 去去壁壁融融合合植植物物組組織織培培養養植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合原理融合前處理誘導融合的方法意義和用途克服遠源雜交的障礙，獲得雜種植株細胞膜的流動性細胞膜的流動性植物細胞的全能性去除細胞壁后誘導原生質體融合使細胞分散后誘導細胞融合物理（電融合法、離心法）化學（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法）物理（電融合法）化學（聚乙二醇（PEG）2融合法）生物方法：滅活的病毒誘導法制備單克隆抗體2.動物細胞融合一.動物細胞工程3.單克隆抗體及其應用抗原不純抗體不純缺陷：產

8、量低、純度低， 且抗體的特異性差、靈敏度低。不能無限增殖產生大量抗體動物體內抗原 刺激漿細胞抗體 篩選單一B細胞增殖分化抗原抗原免疫過程免疫過程傳統抗體傳統抗體多種混合多種混合一.動物細胞工程（1）早期獲得抗體的方法（2）一個大膽的設想 將能夠產生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能量的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。那這樣就能夠提高抗體的產量、同時提高純度和靈敏性。杰尼 丹麥科勒 德國米爾斯坦 英國 創立抗原選擇抗體學說，發明了單克隆抗體技術，因此獲得了創立抗原選擇抗體學說，發明了單克隆抗體技術，因此獲得了19841984年的諾年的諾貝爾生理或醫學獎。貝爾生理或醫學獎。3.單克隆抗體及

9、其應用一.動物細胞工程怎樣才能得到純的抗體？想要獲得單一的純抗體，就必須從一個想要獲得單一的純抗體，就必須從一個B B細胞出發。細胞出發。光純還不行，還要大量，怎么辦？讓讓B B細胞大量繁殖（克隆）就可以產生大量抗體了。細胞大量繁殖（克隆）就可以產生大量抗體了。但，有問題：找，什么細胞能無限增殖呢？B細胞是不能無限增殖的，怎么辦？癌細胞，只有癌細胞。但它不能產生抗體。癌細胞，只有癌細胞。但它不能產生抗體。（2）一個大膽的設想3.單克隆抗體及其應用一.動物細胞工程思路就出來了：（2）一個大膽的設想3.單克隆抗體及其應用一.動物細胞工程一種B淋巴細胞（只產生一種特定抗體）能在體外大量增殖的骨髓瘤細

10、胞動物細動物細胞融合胞融合雜交瘤細胞動物細動物細胞培養胞培養大量的特定抗體（3）單克隆抗體的制備過程注射特定蛋白免疫小鼠培養小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞骨髓瘤細胞多種細胞多種雜交瘤細胞能分泌所需抗體的雜交瘤細胞選擇培養基篩選選擇培養基篩選克隆化培養克隆化培養專一抗體檢測專一抗體檢測注射到小鼠腹腔內增殖體外培養單克隆抗體融合融合3.單克隆抗體及其應用一.動物細胞工程用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產生特定抗體的B淋巴細胞。用特定的選擇培養基進行篩選在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。（3）單克隆抗體的制備過程3.單克隆抗體及

11、其應用一.動物細胞工程對上述經選擇培養的雜交瘤細胞進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選，就可獲得足夠數量的能分泌所需抗體的細胞。將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞在體外條件下大規模培養，或注射到小鼠腹腔內增殖。從細胞培養液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。（3）單克隆抗體的制備過程3.單克隆抗體及其應用一.動物細胞工程單克隆抗體的制備過程第一次篩選資料：細胞合成細胞合成DNADNA有有D D和和S S兩條途徑，其中兩條途徑，其中D D途徑能被氨基途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種喋呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNADNA的合成途徑，但一般的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中只有不分裂

12、增殖。鼠骨髓瘤細胞中只有D D途徑，沒有途徑，沒有S S途徑。途徑。B淋巴細胞骨髓瘤細胞（A）合成DNAD途徑S途徑D途徑氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合多種雜交細胞既能迅速大量增殖既能迅速大量增殖又能產生抗體又能產生抗體篩選雜交瘤細胞（3）單克隆抗體的制備過程一.動物細胞工程AB1、AB2、AB3 專一抗體檢驗陽性：有限稀釋法、抗原-抗體雜交法單克隆抗體的制備過程第二次篩選【原理】將雜交瘤細胞培養液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔將雜交瘤細胞培養液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔里就可能只有里就可能只有1 1個雜

13、交瘤細胞，培養之后個雜交瘤細胞，培養之后( (即即克隆化培養克隆化培養) )，用，用標記的抗原標記的抗原檢測每個小孔檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）。這樣經過上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）。這樣經過多次克隆化培養多次克隆化培養以及以及有限稀釋法有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞（的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞（ABAB3 3）。）。多孔細胞培養板抗體檢測板（3）單克隆抗體的制備過程一.動物細胞工程（3）單克隆抗體的制備過程一.動物細胞工程單克隆抗體的制備過程第二次篩選3.單克隆抗體及其應用（3）

14、單克隆抗體的制備過程一.動物細胞工程（4）單克隆抗體的應用資料1.用用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的做成的 早早孕診斷試劑盒早早孕診斷試劑盒 ，在妊娠，在妊娠第第8 8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10 d10 d左右，可以避免孕婦在不左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%90%以上。以上。單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發生特異性結合，并且可以大量制備。用于多種疾

15、病的診斷和病原體鑒定。作為診斷試劑最廣泛應用一.動物細胞工程甲胎蛋白（AFP）是一種特異性較強的腫瘤標志物，用甲胎蛋白作為_免疫小鼠，制備_，并與含有放射性同位素的標記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標記物通過血液可到達全身幾乎所有組織。由于腫瘤細胞表面的_會和單克隆抗體特異性的結合，所以放射性同位素標記物就不斷積累在_上。通過一定的顯影技術就可以發現腫瘤所在。抗原抗AFP單克隆抗體AFP腫瘤用于疾病檢測（4）單克隆抗體的應用一.動物細胞工程3.單克隆抗體及其應用資料2.使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素

16、沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體床上的應用。抗體藥物偶聯物（藥物偶聯物（ADCADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADCADC通常由抗體、接頭和藥通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示。物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示。用于治療疾病和運載藥物 （4）單克隆抗體的應用一.動物細胞工程3

17、.單克隆抗體及其應用A.特異性強、靈敏度高生物導彈單克隆抗體抗癌藥物B.療效高、毒副作用小 （4）單克隆抗體的應用一.動物細胞工程3.單克隆抗體及其應用用于治療疾病和運載藥物 例1.核苷酸合成有兩個途徑，物質A可以阻斷其中的全合成途徑(如下圖)。正常細胞內含有補救合成途徑所必需的轉化酶和激酶，制備單克隆抗體時選用的骨髓瘤細胞中缺乏轉化酶。現用加入H、A、T三種物質的“HAT培養基”來篩選特定的雜交瘤細胞。關于篩選原理的敘述，正確的是()A.免疫B細胞及其互相融合細胞因全合成途徑被A阻斷而在HAT培養基上不能增殖B.骨髓瘤細胞及其互相融合細胞因無法進行上述兩個途徑而在HAT培養基上不能增殖C.雜

18、交瘤細胞因為可以進行上述兩個途徑所以能在HAT培養基上大量增殖D.HAT培養基上篩選出的所有雜交瘤細胞既能大量增殖又能產生高純度目標抗體B一.動物細胞工程本堂小結一.動物細胞工程一、概念檢測1.下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是（ ）A.它們的原理都涉及細胞膜的流動性B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞D.前者主要是為了獲得細胞產品，后者主要是為了獲得雜種植株2.科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（ ）A. 利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒B.體外培養單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS