1、實驗一植物原生質體的別離和培養一.教學目標：了解植物原生質體作為細胞工程研究的重要意義,了解原生質體活性鑒定的原理.掌握別離和培養原生質體的技術、方法和原理.掌握細胞活性的檢測方法.掌握細胞計數的原理和方法.二.重點：掌握別離和培養原生質體的技術、方法和原理.掌握細胞活性的檢測方法.掌握細胞計數的原理和方法.三.難點：別離和培養原生質體的技術.四.授課方式與教學方法：講解原理、實驗操作示范或具體指導.五.教學內容：實驗原理植物原生質體(protoplast)是除去細胞壁后為原生質所包圍的“裸露細胞,是開展根底研究的理想材料.其中,酶解法別離原生質體是一個常用的技術其原理是植物細胞壁主要由纖維素

2、、半纖維素和果膠質組成,因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分,除去細胞壁,即可得到原生質體.由于原生質體內部與外界環境之間僅隔一層薄薄的細胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性,使原生質體別離后不致膨脹破裂,滲透劑常用甘露醇或蔗糖,酶液還應含一定Ca2+來穩定原生質膜.其次,還應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對別離原生質體的影響.將原生質體接種在培養基上進行培養,細胞壁再生,細胞分裂和再生植株.測定原生質體的活性有多種方法.熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質膜.一旦進入原生質體后

3、,由于受到酯酶分解而產生具有熒光的極性物質熒光素.它不能自由出入原生質膜,因此有活力的細胞能產生熒光,無活力的原生質體不能分解FAD無熒光產生細胞計數一般用血細胞計數極,按白細胞計數法進行計數.從理論上講,植物體的任何一局部都可以通過酶解作用去除細胞壁而得到原生質體.但在實際操作中,只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程.所以,為了制備健康的原生質體,一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數生長期的愈傷組織為材料,一旦細胞具有木質化或次生加厚的外壁,那么不能被酶降解.因此,取材成為實驗成功與否的首要問題.花期短的花瓣,由于其組織鮮嫩,又具有色素標記,是該實驗中較好的材料.實驗方法1 .把葉片或花期短的花瓣洗凈

4、,把外表水吸干.2人一組2 .撕去葉片反面的表皮,用2ml離心管的蓋打下1圓片.圓片扣壓于0.5ml酶液面上.讓去除下表皮的一面接觸酶液,輔滿一層.0.5ml酶液已放入2ml離心管中.酶液：4%干維素酶,2%果膠覆酶,PH5.8,0.6mol/L甘露醇.3 .2830c保溫酶解26h放培養箱中；鏡檢葉肉細胞原生質體.用血球計數板計數.4 .600rpm離心5min,使原生質體沉降.吸除上面的酶液.5 .力口0.2mol/L的加氯化鈣液0.5ml,輕輕吹打均勻.6 .用1mL注射器向離心管底部緩緩注入20%勺蔗糖溶液1ml,出現下部蔗糖液,上部原生質體懸浮液.以600rpm離心10min,在兩液

5、相之間出現一條綠色帶,便是純潔的原生質體.7 .用1mL注射器取出管底的雜質、下部蔗糖溶液和上部氯化鈣液.少許原生質體于載片上,蓋片觀察其形態,檢測純度.8 .加MS培養7液1ml洗滌,輕輕混勻,600rpm離心5min,使原生質體沉降.吸除上面的溶液.9 .加MSW養70.5ml,輕輕混勻,用血球計數板計數細胞密度,FDA染色測定原生質體的活性.10 .扣上蓋子,在26c下進行暗培養.觀察細胞壁的再生和細胞分裂.實驗結果結果討論六.課堂小結：根據學生的實驗結果進行總結.細胞計數板的使用：細胞計數板系一長方形厚玻片,常用的改進牛氏Improved-Neubauer計數板在中央橫溝的兩邊各有一計

6、數室,兩計數室結構完全相同.計數室較兩邊的蓋玻片支柱低0.1毫米.因此,放上蓋玻片時,計數板與其間距即計數室空間的高為0.1毫米圖8-1.在低倍顯微鏡下可見計數室被雙線劃分成9個邊長為1毫米的大方格.四角的大方格又各分為16個中方格,這是用來計數白細胞的.中央大方格被劃分為25個中方格,每一中方格又劃分成16個小方格圖82稱25X16=400小方格,也有的計數板為16X25=400格的,小方格面積一致中央大方格的四角及中央5個中方格16X25者那么為四角上的中方格為紅細胞或血小板計數范圍圖8-4計數血細胞的路線細胞計數先用試管稀釋法制備禽類血細胞懸液：將禽類紅細胞稀釋液I、n分別置水浴鍋中預熱

7、到4142C,取I液1mL于試管中,用吸血管參加新鮮雞血或肝素抗凝血2.霆,再參加n液1mL混勻,置該水浴鍋中保溫50s左右,置室溫,即為待檢的血細胞懸液.可用于充液計數.取干潔的計數板,置于水平的顯微鏡載物臺上,蓋上蓋玻片,使兩側各空出少許.搖勻血細胞懸液,用滴管吸取,將滴管尖輕輕置于蓋玻片邊緣外,讓滴出的血細胞懸液憑毛細管作用吸入計數室內,剛好充滿計數室為宜圖83.靜置2min后計數,先用低倍鏡觀察,不均勻那么拋棄.計數時用虹彩、集光器、反光鏡等調節入射光角度和強度,認清計數室位置.采用“由上至下,由左至右,順序如弓的順序,對壓邊線細胞采取“數上不數下,數左不數右的原那么圖84.依次計數并

8、記錄5個中方格中分別有多少個紅細胞.考前須知1 .計數板、蓋玻片和測定管用清水沖洗,再用綢布或細布沾干.1.1. 液前應充分混勻血細胞懸液,充液要連續、適量,充液后應待血細胞下沉后再計數.3.計數板、蓋玻片、吸血管及測定管等用過后必須立即按要求洗滌干凈.實驗二、細胞膜的通透性觀察實驗目的了解細胞膜的滲透性及各類物質進入細胞的速度.實驗原理將紅細胞放入數種等滲溶液中,由于紅細胞對各種溶質的透性不同,有的溶質可以滲入,有的不能滲入,滲入的溶質能夠提升紅細胞的滲透壓,所以促使水分進入細胞,引起溶血,由于溶質透入速度互不相同,因此溶血時間也不相同.實驗用品一、器材50ml燒杯,試管110cm,10ml

9、移液管,試管架.二、材料羊血.三、試劑J0.17mol/L氯化鈉,0.17mol/L氯化胺,0.17mol/L醋酸胺,0.17mol/L硝酸鈉,0.12mol/草酸胺,0.12mol/硫酸鈉,0.32mol/葡萄糖,0.32mol/甘油,0.32mol/乙醇,0.32mol/丙酮.實驗方法一、羊血細胞懸液取50ml小燒杯一個,加1份羊血和10份0.17mol/L氯化鈉,形成一種不透明的紅色液體,此即稀釋的羊血.二、低滲溶液取試管一支,參加10ml蒸儲水,再參加1ml稀釋羊血,注意觀察溶液顏色的變化,有不透明的紅色逐漸澄清,說明紅細胞發生破裂造成100液細胞溶血,使光線比較容易透過溶液.三、羊紅

10、細胞的滲透性1、取試管一支,參加0.17mol/L氯化鈉10ml,再參加1ml稀釋羊血,輕輕搖動,注意觀察溶液顏色有無變化？有無溶血現象？為什么？2、取試管一支,參加0.17mol/L氯化胺10ml,再參加1ml稀釋羊血,輕輕搖動,注意觀察溶液顏色有無變化？有無溶血現象？為什么？3、分別在另外8種等滲溶液中進行同樣實驗.步驟同2.實驗結果并對實驗結果進行比擬和分析.實驗三細胞骨架的觀察一、實驗目的掌握用光學顯微鏡觀察植物細胞骨架的原理及方法,觀察光學顯微鏡下細胞骨架的網狀結構.二、實驗原理植物細胞用適當濃度的TritonX100處理后,可破壞細胞內蛋白質,但細胞骨架系統的蛋白質卻保護完好.考馬

11、斯亮藍R250(CoomassiebrilliantblueR250)是一種蛋白質染料,處理后的材料用考馬斯亮藍R250(考馬斯亮藍R250)染色后,用光學顯微鏡觀察,可以見到一種網狀結構,即是細胞骨架結構.三、材料洋蔥鱗葉四、試劑1)2%考馬斯亮藍R250染色液：稱考馬斯亮藍R2501g,溶于250ml無水乙醇中,加冰醋酸35ml.再加蒸儲至500ml.(2)磷酸緩沖液(pH6.8):6.0mmol/L磷酸緩沖液,調至pH6.8M緩沖液(pH7.2)50mmol/L咪口坐,50mmol/L)氯化鉀、0.5mmo/L氯化鎂、1mmol/L乙二醇(a-氨基乙基)醴四乙酸、0.1mmol/L乙二胺

12、四乙酸；1mmol/L疏基乙醇,調至pH7.2.(4)1%TrionX-100:用M緩沖液配制.(5)3%戊二醛：用磷酸緩沖液配制；(6)中性樹膠.儀器(請參看)：顯微鏡,燒杯,鑲子.玻璃滴管,載玻片五、實驗步驟1 .用鑲子撕取洋蔥鱗葉內側的表皮假設干片約1cm大小假設干片,置于50mLs杯中,加入pH6.8磷酸緩沖液,使其下沉；2 .吸去磷酸緩沖液,用1%TritonX100處理20min.3 .吸去TritonX100,用M緩沖液洗3次,每次5min.4 .用3%戊二醛固定30min.5 .磷酸緩沖液pH6.8洗3次,每次5min.7 .蒸儲水洗2次,然后將樣品置于載玻片上,加蓋玻片,于普

13、通光學顯微鏡下觀察.8 .如果染色效果好,那么可依次用50%乙醇、70充醇,95%乙醇、正丁醇、二甲苯處理樣品,各5min,然后將樣品平展于載玻片上,加一滴中性樹膠,蓋上蓋玻片封片,制成永久切片.六、實驗報告描繪所觀察到的洋蔥鱗葉細胞骨架圖.實驗四、線粒體和液泡系的超活染色與觀察活體染色是能使生活有機體的細胞或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害作用的一種活體染色方法,其目的是顯示生活細胞內的某些結構,而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡.活體染色技術可用來研究生活狀態下的細胞形態結構和生理、病理狀態.通常把活體染色分為體內活體染色與體外活體染色兩類.體外活體染色又稱

14、超活染色,它是由活的動、植物別離出局部細胞或組織小塊,以染料溶液浸染,染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色.活體染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊的局部,主要是靠染料的“電化學特性.堿性染料的膠粒外表帶陽離子,酸性染料的膠粒外表帶有陰離子,而被染的局部本身也是具有陰離子或陽離子,這樣,它們彼此之間就發生了吸引作用.但并非任何染料均可用于活體染色,理論上應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料,且使用時需要配成稀淡的溶液.一般說來,最為適用的是堿性染料,這可能是由于它具有溶解在類脂質如卵磷脂、膽固醇等的特性,易于被細胞吸收.詹納斯綠BJanusgreenB和中性紅neutralred兩種堿

15、性染料是活體染色劑中最重要的染料,對于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性.實驗目的1、觀察動、植物活細胞內線粒體、液泡系的形態、數量與分布；2、學習一些細胞器的超活染色技術.實驗原理線粒體是細胞內一種重要細胞器,是細胞進行呼吸作用的場所.細胞的各項活動所需要的能量,主要是通過線粒體呼吸作用來提供的.活體染色是應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內某些結構而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法.詹納斯綠B是線垃體的專一性活體染色劑.線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態即有色狀態呈藍綠色,而在周圍的細胞質中染料被復原,成為無色狀態.中性紅為弱堿性染料,對液泡系即高爾基體的染色有專一性,只

16、將活細胞中的液泡系染成紅色,細胞核與細胞質完全不著色,這可能是與液泡中某些蛋白質有關.實驗用品1、器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑲子、雙面刀片、解剖盤.載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、外表皿、吸管、牙簽、吸水紙.2、試劑(1) Ringer溶液：氯化鈉0.85g(變溫動物用0.65g)氯化鉀0.25g氯化鉀0.25g氯化鈣0.03g蒸儲水100ml(2) 10%1/3000中性紅溶液：稱取0.5g中性紅溶于50mlRinger液,稍加熱(3040C)使之很快溶解,用濾紙過濾,裝入棕色瓶于暗處保存,否那么易氧化沉淀,失去染色水平.臨用前,取已配制的1%M生紅溶液1ml,參加29mlRinge

17、r溶液混勻,裝入棕色瓶備用.(3) 1%、1/5000詹納斯綠B溶液稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中,稍加微熱(3040),使之溶解,用濾紙過濾后,即為1%原液.取1%京7取lml參加49mlRinger溶液,即成1/5000工作液裝入瓶中備用.最好現用現配,以保持它的充分氧化水平.實驗材料人口腔上皮細胞,小麥種子或黃豆幼根根尖.實驗方法1、人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37c恒溫水浴鍋的金屬板上滴2滴1/5000詹納斯綠B染液用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中染色10l5min注意不可使染液枯燥,必要時可再加滴染液

18、蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察2、植物細胞液泡系的超活染色與觀察取豆芽的根尖J用刀片縱切根尖放入中性紅染液滴中,染色510min.吸去染液,滴一滴Ringer液蓋上蓋玻片進行鏡檢鑲子輕輕地下壓蓋玻片,使根尖壓扁,利于觀察實驗結果在高倍鏡下,先觀察根尖局部的生長點的細胞,可見細胞質中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡,這是初生的幼小液泡.然后,由生長點向延長區觀察,在一些已分化長大的細胞內,液泡的染色較淺,體積增大,數目變少在成熟區細胞中,一般只有一個淡紅色的巨大液泡,占據細胞的絕大局部,將細胞核擠到細胞一側貼近細胞壁處.實驗報告(1) .繪口腔上皮細胞示線粒體的形態與分布(2) .繪蟾蛛胸骨劍

19、突軟骨細胞示液泡系的形態與分布實驗五葉綠體的別離與熒光觀察葉綠體是植物細胞所特有的能量轉換細胞器,光合作用就是在葉綠體中進行的,由于具有這一重要功能,所以葉綠體一直是細胞生物學、遺傳學和分子生物學的重要研究對象.葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器,利用低速離心即可別離集中進行各種研究.實驗目的1 .通過植物細胞葉綠體的別離,了解細胞器別離的一般原理和方法.2 .觀察葉綠體的自發熒光和次生熒光,并熟悉熒光顯微鏡的使用方法.實驗原理將組織勻漿后懸浮在等滲介質中進行差速離心,是別離細胞器的常用方法.一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度,也同離心力以及懸浮介質的粘度有關.在一給定的

20、離心場中,同一時間內,密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同.依次增加離心力和離心時間,就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部,分批收集即可獲得各種亞細胞組分.葉綠體的別離應在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進行,以免滲透壓的改變使葉綠體到損傷.將勻漿液1000r/min的條件下離心2min,以去除其中的組織殘渣和未被破碎的完整細胞.然后,在3000r/min的條件下離心5min,即可獲得沉淀的葉綠體(混有局部細胞核).別離過程最好在05c的條件下進行；如果在室溫下,要迅速別離和觀察.利用熒光顯微鏡對可發熒光的物質進行檢測時,將受到許多因

21、素的影響,如溫度、光、淬滅劑等.因此在熒光觀察時應抓緊時間,有必要時立即拍照.另外,在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油.實驗用品一、器材1 .主要設備：普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡.2 .小型器材:500ml燒杯2個,250ml量筒1個,滴管20支,10ml刻度離心管20支,試管架5個,紗布假設干,無熒光載片和蓋片各4片.二、材料新鮮菠菜.三、試齊U0.35mol/L氯化鈉溶液,0.01%口丫噬橙(acridineorange).實驗方法一、葉綠體的別離與觀察1 .選取新鮮的嫩菠菜葉,洗凈擦干后去除葉梗脈,稱30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中,

22、裝入組織搗碎機.2 .利用組織搗碎機低速(5000r/min)勻槳35min.3 .將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中.4 .取濾液4ml在1000r/min下離心2min.棄去沉淀.5 .將上清液在3000r/min下離心5min.棄去上清液,沉淀即不葉綠體(混有局部細胞核).6 .將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮、7.取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上,加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察.(1)在普通光鏡下觀察.(2)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光.(3)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光：取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上,再滴加一滴0.01%口丫噬橙熒光染料,加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察.二、菠菜葉手切片觀察用剔須刀片將新鮮的嫩菠菜葉切削出一斜面置于載玻片上,滴加12滴0.35mol/LNaCl