1、1實驗研究的目的性實驗研究的目的性 功能、形態、數量功能、形態、數量實驗設計的科學性實驗設計的科學性 全面、動態、鮮明、對應、對照全面、動態、鮮明、對應、對照實驗方法的合理性實驗方法的合理性 確切、先進確切、先進實驗原理的內涵性實驗原理的內涵性 意義、要點意義、要點實驗操作的規范性實驗操作的規范性 準備、嚴格、準確、重復準備、嚴格、準確、重復2免疫血清和單克隆抗體的制備免疫血清和單克隆抗體的制備3一、免疫血清的制備一、免疫血清的制備1. 原理：原理： 機體具有多種機體具有多種B細胞克隆，細胞克隆，將適當的抗原物質注入人將適當的抗原物質注入人或動物體內或動物體內后可被不同的后可被不同的B細胞克隆

2、同時識別，細胞克隆同時識別，經過一定經過一定時間，時間，受刺激的受刺激的B細胞克隆針對抗原表位的多少而產生相細胞克隆針對抗原表位的多少而產生相應的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發相應應的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發相應B細胞克隆細胞克隆產生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的產生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。 優質免疫血清的產生，主要取決于抗原的純度和免疫優質免疫血清的產生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動物的免疫應答能力。此外，尚需考慮免疫途原性，以及動物的免疫

3、應答能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數、時間間隔和有無佐劑等因素。徑、抗原劑量、注射次數、時間間隔和有無佐劑等因素。454. 抗原的處理抗原的處理1）顆粒性抗原：紅細胞、菌體等制成懸液，不需佐）顆粒性抗原：紅細胞、菌體等制成懸液，不需佐 劑，直接免疫。菌體數劑，直接免疫。菌體數11010個個/ml 為宜。為宜。2）可溶性蛋白質抗原（如人）可溶性蛋白質抗原（如人IgG）、病毒抗原、細菌）、病毒抗原、細菌 可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑 （1：1 V/V）混合、乳化。）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化學藥品）需與載）半抗原

4、（多糖、多肽、激素、化學藥品）需與載 體偶聯。常用載體有牛血清白蛋白（體偶聯。常用載體有牛血清白蛋白（BSA）、鑰）、鑰 孔嘁血藍素孔嘁血藍素(KLH)、雞血清蛋白（、雞血清蛋白（OA）；偶聯劑）；偶聯劑 有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。KLH是最是最 常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯 劑。劑。673. 弗氏完全佐劑弗氏完全佐劑 1）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液體石蠟）配方：羊毛脂：液體石蠟 為為1：2，也可，也可1：1。 滅活卡介苗滅活卡介苗

5、（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4. 弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 劑。劑。5. 用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。89102. 可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基礎免疫（初次免疫）后三周左右，進行）方法：基礎免疫（初次免疫）后三周左右，進行 加強免疫，以后每隔加強免疫，以后每隔2周加強免疫一次。周加強免疫一次。 2）加強免疫次數取決于試血結果。家兔耳緣靜脈、）加強免疫次數取決于試血結果。家兔耳緣靜脈、 小鼠眶靜脈少量采血，分離血清，免疫雙擴實驗小鼠眶靜脈少量采血，分離血清，

6、免疫雙擴實驗 測定血清效價測定血清效價1：32或或ELISA法測定抗體效價法測定抗體效價 1：10 000，表明抗體效價較高，可采兔頸動脈，表明抗體效價較高，可采兔頸動脈 或心臟全部血液，分離血清。或心臟全部血液，分離血清。 4）如抗體效價較低，繼續加強免疫，一般需）如抗體效價較低，繼續加強免疫，一般需45 次。若仍不能達到抗體效價要求，應考慮重新免次。若仍不能達到抗體效價要求，應考慮重新免 疫。疫。 3. 顆粒性抗原免疫顆粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，隨后每周加強免疫次，隨后每周加強免疫1次，次，45天天 試血。試血。113. 操作程序操作程序 1）健康雄性家兔體重）健康雄性家兔體

7、重2.5 3 kg，背部皮下多點注射。，背部皮下多點注射。2）基礎免疫：抗原完全佐劑）基礎免疫：抗原完全佐劑 (抗原劑量抗原劑量4mg/只只) 2ml (1:1V/V) 吸入兩支注射器內，三通連接，吸入兩支注射器內，三通連接， 反復推拉混合至乳化懸液。反復推拉混合至乳化懸液。3）加強免疫：抗原不完全佐劑）加強免疫：抗原不完全佐劑 (抗原劑量抗原劑量2.5mg/只只)， 間隔間隔710天加強一次。約天加強一次。約23次。次。4）試）試 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量靜脈血，免疫雙天取少量靜脈血，免疫雙 擴試驗血清檢測，抗血清效價擴試驗血清檢測，抗血清效價 1：32（或（或 ELISA

8、法檢測抗體效價法檢測抗體效價1：10，000）時頸）時頸 動脈放血，分離血清，分裝，保存。動脈放血，分離血清，分裝，保存。12二二 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 1975年年 Kohler和和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞發現將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無性繁殖，從而創立雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無性繁殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術，這項技術上的突破使血清了單克隆抗體雜交瘤技術，這項技術上的突破使血清學的研究進入了一個高度準確的新紀元。學的研究進入了一個高度準確的新紀元。

9、1314 2. 試劑與器材試劑與器材（1）細胞融合劑：聚乙二醇（）細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺貯存液谷氨酰胺貯存液（3）200 雙抗（青、鏈霉素）溶液雙抗（青、鏈霉素）溶液（4）RPMI-1640培養液培養液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培養液培養液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）貯存液）貯存液（7）100 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液（8）1 HAT培養液培養液（9）1 HT培養液培養液（10）100 8-雜氮鳥嘌呤貯存液雜氮鳥嘌呤貯存液15（11）細胞凍存液：）細胞凍存液：90ml含含30%FCS的的R

10、PMI-1640培養培養 液液+10ml DMSO （12）0.2M pH 7.4 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液（13）主要儀器設備：）主要儀器設備：CO2培養箱、超凈工作臺、倒置培養箱、超凈工作臺、倒置 顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、 離心機、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾離心機、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾 器、酶聯免疫測定儀等。器、酶聯免疫測定儀等。（14）常規實驗器材：血細胞記數板、各種吸管、離心）常規實驗器材：血細胞記數板、各種吸管、離心 管、細胞培養瓶、培養皿、管、細胞培養瓶、培養皿、24孔和孔和96孔培養板、孔培養板、 細胞

11、凍存管、注射器、微量移液器等。細胞凍存管、注射器、微量移液器等。（15）抗體純化器材與試劑。）抗體純化器材與試劑。（16）小鼠實驗器材：手術剪刀、鑷子等解剖器材。）小鼠實驗器材：手術剪刀、鑷子等解剖器材。（17）骨髓瘤細胞：小鼠骨髓瘤細胞系）骨髓瘤細胞：小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0或或NS-1。163. 實驗流程實驗流程（1）實驗動物免疫：）實驗動物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。 常規免疫方案：常規免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制備脾細后制備脾細 胞懸液。胞懸液。基礎免疫：基礎免疫：10100 g抗原抗原 (可溶性抗原可溶性抗原)完全佐劑完全佐劑 0.2ml (1

12、:1V/V) ，背部皮下多點注射。，背部皮下多點注射。加強免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔加強免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔710天一天一 次。約次。約23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹腔注射。 試試 血：取靜脈血，血：取靜脈血，ELISA法檢測血清中抗體滴度，法檢測血清中抗體滴度， 當效價達到當效價達到 1：400以上時，進行加強免疫。以上時，進行加強免疫。 弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。17（2）免疫動物脾細胞懸液的制備）免疫動物脾細胞懸液的制備 ： 將末次免疫后將末次免疫后3天天BALB/c小鼠處死，消毒，無菌小鼠處死，消毒

13、，無菌取出脾臟，置入無菌取出脾臟，置入無菌PBS或培養液中。在或培養液中。在100目的鋼網目的鋼網上研磨脾臟。收集細胞于上研磨脾臟。收集細胞于50ml離心管中，離心管中，1500rpm離心離心5分，去上清。加入分，去上清。加入10ml PBS用吸管輕微混勻，用吸管輕微混勻，1500rpm離心離心5分，去上清，用分，去上清，用10ml RPMI培養液懸浮。培養液懸浮。 細胞計數（細胞數細胞計數（細胞數/ml=N/4 104 稀釋倍數）稀釋倍數） 用用1640培養液調整細胞濃度至培養液調整細胞濃度至1 108 /ml 18（3 3）飼養細胞制備）飼養細胞制備 在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易

14、生長在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其他活細胞則可促進這些細胞生長繁殖，繁殖，若加入其他活細胞則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的細胞稱飼養細胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細所加入的細胞稱飼養細胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細胞胞。 將正常將正常BALB/cBALB/c小鼠腹部消毒后，注射預冷的無血小鼠腹部消毒后，注射預冷的無血清培養液清培養液5ml5ml，輕揉腹部數次，于腹部左下處剪開腹膜，輕揉腹部數次，于腹部左下處剪開腹膜，吸取細胞懸液，反復吸取細胞懸液，反復2 23 3次，用培養液離心洗滌次，用培養液離心洗滌2 2次。次。用用15%FCS-RPMI-164015%FCS-RPMI

15、-1640調細胞濃度為調細胞濃度為2 2 10105 5/ml/ml，將細胞，將細胞接種于接種于9696孔培養板，孔培養板，100100 l/l/孔。孔。 19（4 4）骨髓瘤細胞的準備）骨髓瘤細胞的準備 復蘇骨髓瘤細胞用復蘇骨髓瘤細胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPMI-1640培養液培培養液培養養1 1周，周，2 23 3天換液一次，依細胞生長情況天換液一次，依細胞生長情況3 34 4天傳代天傳代一次，適宜密度一次，適宜密度3 310105 5/ml/ml。融合之前。融合之前3 3天，每天換一天，每天換一半培養液，使細胞保持在對數生長期。取對數生長骨半培養液，使細胞保持在對

16、數生長期。取對數生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗2 2次，次，調細胞濃度調細胞濃度為為12 107 / ml備用。備用。 2021（6）融合細胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測）融合細胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測 細胞培養細胞培養3天后，使用天后，使用HAT培養液換液；培養液換液；3天后，再天后，再次使用次使用HAT培養液換液。培養液換液。 當細胞克隆集落大于當細胞克隆集落大于3mm時，利用間接時，利用間接ELISA法篩法篩選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞克隆。選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞克隆。22（7）雜交瘤細胞克隆化）雜交瘤細胞克隆化 將分泌單克隆抗體陽性的

17、雜交瘤細胞克隆按有限將分泌單克隆抗體陽性的雜交瘤細胞克隆按有限稀釋法稀釋細胞（用稀釋法稀釋細胞（用HAT培養液稀釋細胞），于培養液稀釋細胞），于96孔孔培養板中加入培養板中加入0.1ml/孔，培養孔，培養2周，利用間接周，利用間接ELISA法法挑選單個陽性雜交瘤細胞克隆孔并再次進行亞克隆，挑選單個陽性雜交瘤細胞克隆孔并再次進行亞克隆，直至亞克隆時全部克隆孔細胞培養上清中抗體檢出陽直至亞克隆時全部克隆孔細胞培養上清中抗體檢出陽性率為性率為100%為止。為止。23（8）雜交瘤細胞凍存與復蘇）雜交瘤細胞凍存與復蘇 將陽性細胞克隆在培養板或培養瓶中擴大培養，將陽性細胞克隆在培養板或培養瓶中擴大培養，收

18、集細胞，離心收集細胞，離心1000轉、轉、5分，棄上清，加入細胞凍存分，棄上清，加入細胞凍存液，移至凍存管，液，移至凍存管，-70冰箱過夜，然后液氮長期保存。冰箱過夜，然后液氮長期保存。 將凍存管從液氮中取出，立即放入將凍存管從液氮中取出，立即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培養液洗滌使之迅速融化。用培養液洗滌1次后，加入培養液繼續次后，加入培養液繼續培養。培養。24（9）單克隆抗體的大量制備）單克隆抗體的大量制備 BALB/c雌性小鼠接種雜交瘤細胞前雌性小鼠接種雜交瘤細胞前12周，腹腔注周，腹腔注射降植烷預處理。用無血清培養液洗滌雜交瘤細胞射降植烷預處理。用無血清培養液洗滌雜交瘤細胞

19、23次，次，調細胞濃度調細胞濃度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml細胞細胞懸液。待小鼠腹部明顯膨大時，收集腹水，離心，收集上懸液。待小鼠腹部明顯膨大時，收集腹水，離心，收集上清，分裝，清，分裝，-80保存。保存。25（10）單克隆抗體純化）單克隆抗體純化鹽析法鹽析法 腹水腹水10ml等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸胺滴緩慢加入飽和硫酸胺20ml，4放置放置0.5h以上或過夜。以上或過夜。離心（離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加生理鹽水，棄上清。沉淀加生理鹽水20ml溶解后，再次加入飽和硫酸胺溶解后，

20、再次加入飽和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或過夜。離心（或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加盡，棄上清。沉淀加盡量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動自來水透量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動自來水透析析40min，再用生理鹽水透析，再用生理鹽水透析24h，中間換液，中間換液34次，檢次，檢測無測無NH4離子存在即可。離子存在即可。-20備用。備用。26凝膠柱層析凝膠柱層析 實驗原理：實驗原理： 凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯劑作用下形成凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯劑作用下形成三維空間網狀結構，蛋白質溶液流經凝膠柱時，根據三維空間網狀結構，蛋白質溶液流經凝膠柱時

21、，根據蛋白質分子量的大小不同，由大到小洗脫而進行分離。蛋白質分子量的大小不同，由大到小洗脫而進行分離。（大分子蛋白質不能進入凝膠粒內部，在膠粒間隙隨（大分子蛋白質不能進入凝膠粒內部，在膠粒間隙隨洗脫液最先流出。而小分子蛋白質進入膠粒內部洗脫洗脫液最先流出。而小分子蛋白質進入膠粒內部洗脫較慢。）較慢。） 關鍵點：關鍵點：1. 裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱；裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱；2. 加樣時緩沖液面恰好在濾紙片上，及時加樣避免柱加樣時緩沖液面恰好在濾紙片上，及時加樣避免柱 干涸，干涸凝膠不能繼續使用；干涸，干涸凝膠不能繼續使用；3. 因操作時間長，宜在因操作時間長，宜在4操作，防止影響免疫球蛋白操作，防止影響免疫球蛋白 活性。活性。27（1111）單克隆抗體免疫學性質檢定）單克隆抗體免疫學性質檢定 1 1）單克隆抗體特異性測定；）單克隆抗體特異性測定； 2 2）單克隆抗體亞類測定；）單克隆抗體亞類測定； 3 3）單克隆抗