1、抗PTDbcr/abl單克隆抗體的制備及鑒定         11-01-31 10:11:00     作者：陳任安    編輯：studa20【摘要】  目的: 制備單克隆抗體（mAb）并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究, 為慢性粒細胞白血病的免疫治療提供實驗依據。方法: 在大腸桿菌中表達PTDbcr/abl融合蛋白, 用所獲得的蛋白免疫BALB/c小鼠, 常規收集小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合, 篩選雜交瘤細胞

2、株的陽性克隆, 并對其進行一系列鑒定。結果: （1）表達PTDbcr/abl融合蛋白; （2）制備了抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb; （3）用mAb以多種方法檢測PTDbcr/abl融合蛋白, 證實此抗體效價高, 特異性強。結論: 此抗體可用于PTDbcr/abl融合蛋白的進一步研究。 【關鍵詞】  PTDbcr abl融合蛋白 單克隆抗體 制備    PTDbcr/abl是一種利用基因工程合成的融合蛋白1, 2。其中PTD（蛋白轉導結構域）是人類免疫缺陷病毒（HIV）1所編碼的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段, 具有獨特的跨膜轉運方式, 其特點是

3、轉導速度快, 效率高。Schwarze等3發現將PTD融合于相對分子質量(Mr)為15×1032×105的蛋白時, 可介導這些蛋白從細胞外向細胞內直接跨膜轉運。Bcr/Abl是慢性粒細胞白血病（CML）細胞中特異的bcr/abl融合基因所編碼的融合蛋白, 其Mr為21×104, 具有異常的酪氨酸激酶活性。我們以前已利用基因重組方法構建了PTDbcr/abl的原核表達質粒, 并在大腸桿菌中獲得表達。而且證實表達產物PTDbcr/abl融合蛋白與K562或HL60細胞共同孵育后, 可進入細胞內1。我們用純化的PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 常規

4、收集小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合, 篩選雜交瘤細胞株的陽性克隆。經ELISA、 Western blot及免疫組化方法檢驗, 證實mAb特異性強, 效價高, 可用于PTDcr/abl融合蛋白的進一步研究。1  材料和方法1.1  材料 大腸桿菌BL21購自Navagene公司。表達PTDbcr/abl融合蛋白的質粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562細胞株由本室構建保存; BALB/c小鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供; 免疫組化試劑盒(鏈親和素抗生物素蛋白過氧化酶免疫組化超敏試劑盒)購自邁新公司; 小鼠IgG亞類快速定性試紙購于法國Arge

5、n公司; HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體(由華美生物提供); 免疫球蛋白標準亞類試劑購自Sigma公司。1.2  方法bcr/abl融合蛋白的表達與純化 質粒pET16bPTD與質粒pET16bPTDbcr/abl的制備按照文獻1進行。用pET16bPTDbcr/abl轉化大腸桿菌BL21, 取陽性克隆培養擴增, 用IPTG進行誘導表達后收集菌體, PBS懸浮, 超聲裂菌, 并用8 mol/L脲溶解蛋白, 用8mol/L脲（pH值分別是8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在NiNTAagarosePAGE電泳, 成為蛋白膠。按參考文獻4進行。取蛋白膠（含蛋白1） 40 m

6、g與125 L完全福氏佐劑, 125 L PBS充分研磨后, 背部皮下多點注射免疫BALB/c 小鼠。2周后用蛋白膠（含蛋白1） 40 mg與125 L不完全福氏佐劑, 125 L PBS充分研磨后, 皮下多點注射, 連續3次, 每次間隔2周, 第3次免疫后14 d, 用PTDbcr/abl 純化蛋白50 g/500 L小鼠腹腔注射, 加強免疫1次, 3 d后取小鼠脾臟待用。取免疫小鼠脾細胞與Sp2/0細胞按101的比例, 在500 g/L(W/V)PEG 4000介導下融合, 融合細胞用HAT培養基做選擇性培養, 37、 50 mL/L CO2孵箱培養, 7 d后改用HT培養基培養。采用間接

7、ELISA法做交叉篩選。將PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一帶有His標簽的蛋白, 文章另發)(對照孔)稀釋為10 mg/L, 包被96孔酶標板, 100 L/每孔, 4包被過夜, 次日用10 g/L BSA 120 L/孔封閉后,  分別取待測雜交瘤上清液100 L加入PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107包被板中, 4過夜; 用PBSTween20洗板5次, 加HRP羊抗鼠IgG(11000稀釋) 100 L/孔, 37、 1 h; PBSTween20洗板5次, TMB顯色; 2 mol/L H2SO4終止反應。置酶標儀450 nm波長測量A值, A450值大于陰性對照孔2.1倍以上為陽性, 選取PTDbcr/abl融合蛋白陽性而HisTaxreb107陰性的孔細胞, 采用有限稀釋法進行亞克隆, 至所有雜交瘤上清液均呈陽性為建株標準。每只BALB/c小鼠腹腔內注入0.5 mL液體石蠟, 1周后將陽性雜交瘤細胞注入小鼠腹腔內, 5×106雜交瘤細胞/只。大約710 d后收集腹水, 按常規經飽和硫酸銨鹽析、 ProteinG親和層析進行純化。用紫外分光光度法測定其濃度, 加入終濃