1、分 類 號 學(xué)號 M200971420學(xué)校代碼10487密級 乏氧鼠腦氧化還原狀態(tài)的低溫成像初步研究學(xué)位申請人： 覃漢兵學(xué)科專業(yè)： 生物化學(xué)與指導(dǎo)教師： 張智紅 教授生物學(xué)答辯日期： 2012 年 1 月 19 日A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of SciencePreliminary Study on Redox State of HypoxicMouse Brain by Cryo-ImagingCandidate:Qin Hanbing

2、Major:Biochemistry andMolecular BiologySupervisor:Prof. Zhang ZhihongHuazhong University of Science & TechnologyWuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaJanuary, 2012獨(dú)創(chuàng)性本人所呈交的是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明的內(nèi)容外，本不包含任何其他個人或集體已經(jīng)或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全本的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：日期：年月日使用書本作

3、者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用的規(guī)定，即：學(xué)校保留并向有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交的復(fù)印件和，被查閱和借閱。本人華技大學(xué)可以將本的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等保存和匯編本。，在年后適用本書。本屬于不。（請在以上方框內(nèi)打“”）作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日華技 大 學(xué)摘要*腦組織氧化還原代謝反應(yīng)的正常進(jìn)行，是維持腦組織結(jié)構(gòu)完整和功能正常的前提。腦組織氧化還原代謝狀態(tài)的正常維持需要持續(xù)有效的氧氣供應(yīng)，空氣氧分壓的細(xì)微變化都可能導(dǎo)致腦組織氧化還原狀態(tài)的改變，即引起腦細(xì)胞線粒體中的 NADH 和 Fp 兩種內(nèi)源性輔酶的濃度發(fā)生改變。本文將內(nèi)源性熒光成像技術(shù)和組

4、織氧化還原代謝狀態(tài)低溫速凍、維持技術(shù)相結(jié)合，利用多通道低溫斷層熒光顯微成像技術(shù)獲取了小鼠全腦在乏氧后的氧化還原代謝狀態(tài)的多截面分布信息，這將有助于人們進(jìn)一步加深認(rèn)識不同生理病理狀況下，腦組織的氧化還原代謝情況與其內(nèi)源性輔酶的關(guān)系，為腦氧化還原代謝異常的特異性診斷、治療以及治療后效應(yīng)的評價提供了方法。本文主要的工作包括：1、比較了斷首液氮速凍法、直接整鼠液氮速凍法和漏斗式液氮速凍法三種常見固定實(shí)驗(yàn)鼠腦氧化還原代謝狀態(tài)的方法，并根據(jù)樣品結(jié)構(gòu)固定完整程度、樣品氧化還原代謝狀態(tài)的均一性，確定了漏斗法作為適宜本研究的樣品技術(shù)。2、液氮低溫環(huán)境可以有效維持生物組織樣品的氧化還原代謝狀態(tài)不變，本文依據(jù)液氮低

5、溫技術(shù)的基本原理，構(gòu)建液氮低溫環(huán)境，并自行設(shè)計和制作了相應(yīng)的模塊， 確保樣品始終浸潤在液氮環(huán)境中以便在樣品銑削以及成像過程中維持組織樣品氧化 還原代謝狀態(tài)不變。3、在液氮低溫環(huán)境下，采用了多通道低溫三維熒光成像系統(tǒng)獲取了小鼠乏氧和正常生理狀態(tài)下 NADH 和 Fp 兩種輔酶濃度的分布信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乏氧鼠腦呈現(xiàn)整體高還原性，并且乏氧鼠腦的白質(zhì)與灰質(zhì)之間的區(qū)域差異性與正常鼠腦兩種組織間的區(qū)域差異性剛好相反。：氧化還原狀態(tài) 液氮低溫環(huán)境 內(nèi)源性熒光乏氧鼠腦 低溫成像技術(shù)本課題受到自然科學(xué)基金（30801482）光電基金（2009，張智紅）和 111 計劃（B07038）*的資助。I華技 大 學(xué)Abs

6、tract*That, the brain tissue redox metabolic continues well, is the premise to maintain normal brain structure and function. It needs continuous and effective blood supply to keep the balance of brain tissue metabolic redox status, because even a subtle change of blood flow or blood oxygen may lead

7、to dramatic change of the metabolic redox status, which results in the concentration change of NADH and Fp in the brain cells' mitochondria. In this thesis, we have combined the endogenous fluorescent molecular imaging techniques with the low-temperature fixation technology of tissue energy meta

8、bolic status, and access to the information of the multi-sectional distribution of the whole Kunming mouse brain metabolic redox status under hypoxia. The research would be helpful for raising awareness of the relationship between the brain energy metabolism under different physiological and patholo

9、gical conditions and the endogenous coenzyme, and supplying methods for the brain metabolic abnormal specific diagnosis, treatment and following steps.This thesis includes:1. Three common fixation methods, decapitation freezing method, direct freezing method and funnel freezing method, were compared

10、. At last, we decided to choose the funnel freezing method according to the fixed complete degree of the sample structure and the sample status homogeneity.2. According to the relationship between rate and temperature the of biochemical reactions inside the body, we knew that to ensure a stable fixa

11、tion metabolic state, we must keep them in liquid nitrogen. Therefore, this thesis explored the low temperature maintenance technology using self-designed corresponding modules to keep the sample in liquid nitrogen condition.3. We used the multi-channel three-dimensional fluorescence imaging system

12、to acquire the mouse brains NADH and Fp coenzyme concentration distribution informationof death and different physiological conditions under the environment of low temperaturesThis work is supported by National Natural Science Foundation of China (No. 30801482)、Director Fund of Wuhan*National Labora

13、tory for Optoelectronics（2009, Z.H. ZHANG）、111 Project of China (B07038).II華技 大 學(xué)in liquid nitrogen. Moreover, we found that the hypoxic mouse brain was in overall high oxygen reduction; and the regional difference between brain white matter and gray matterof the hypoxic and normal brains was just t

14、he opposite.Keywords:redox state, low temperature environment of liquid nitrogen,intrinsicfluorescent molecular，hypoxic mouse brain, cryo-imagingIII華技 大 學(xué)目 錄摘 要IAbstractII1緒論1腦組織氧化還原代謝反應(yīng)過程概述1腦組織氧化還原狀態(tài)檢測技術(shù)概述21.11.21.31.41.5測氧化還原狀態(tài)的熒光成像技術(shù)3大樣品低溫速凍技術(shù)概述8本課題的主要研究內(nèi)容102鼠腦樣品的低溫方法132.12.22.32.42.52.6引言13固定組織氧

15、化還原狀態(tài)的低溫技術(shù)13三種低溫樣品方法16結(jié)果與分析20討論24小結(jié)253低溫成像環(huán)境的維持方法263.13.23.33.43.5引言26低溫環(huán)境構(gòu)建的條件和方法26低溫環(huán)境組成的三大模塊29結(jié)果與分析39小結(jié)414乏氧鼠腦氧化還原狀態(tài)的低溫成像424.14.24.34.44.5引言42材料與方法43結(jié)果與分析49討論55小結(jié)575總結(jié)與展望585.1總結(jié)585.2展望59謝60致IV華技 大 學(xué)參考文獻(xiàn)61錄66附V華技 大 學(xué)1緒論1.1 腦組織氧化還原代謝反應(yīng)過程概述腦組織細(xì)胞生命活動所需要的直接能量來源是 ATP 的高能磷酸鍵斷裂時所的能量，而腦組織內(nèi)的 ATP 則主要是在葡萄糖逐步

16、氧化分解成和水的過程中生成的1。組織消耗的葡萄糖多來自溶解在血液中的葡萄糖（即血糖 Blood Sugar，Glu），其濃度水平穩(wěn)定，在一類被稱作葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 GLUT 的小蛋白質(zhì)的作用下進(jìn)入組織細(xì)胞，開始其為生命活動供能的糖的氧化還原代謝過程2。糖氧化還原代謝主要分為無氧的糖酵解（ Glycolysis ）和有氧的氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）兩個過程，其物理化學(xué)本質(zhì)就是電子轉(zhuǎn)移過程。獲得電子的反應(yīng)即為還原反應(yīng)，失去電子的反應(yīng)稱為氧化反應(yīng)，且氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)是不可 的。糖的氧化還原代謝過程如下1,3：葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中經(jīng)糖酵解途徑（Glycolytic

17、Pathway）分解成酸（PyruvicAcid）部分能量酸粒體（Mitochondrion）基質(zhì)中經(jīng)氧化脫羧（OxidativeDecarboxylation）反應(yīng)變成乙酰輔酶 A（Acetyl Coenzyme A），部分能量。乙酰輔酶A粒體基質(zhì)中經(jīng)三Tricarboxylic Acid Cycle）及氧化磷酸化（OxidativePhosphorylation）生成和水，大量能量。這些氧化脫氫過程所產(chǎn)生的煙堿腺嘌呤核苷酸NADH 和還原性氫H+和黃素蛋白FADH2 等還原當(dāng)量可將其還原性氫傳遞給電子呼吸鏈來產(chǎn)生 ATP，供生命活動所需1,3。葡萄糖的氧化還原過程的總的方程式如式（1-1）

18、所示。葡萄糖+38ADP+38Pi+6O238ATP+44H2O+6CO2（1-1）在這個氧化還原過程中，NAD+和 FAD 這兩個氧化型輔酶捕獲還原性氫變成NADH 和FADH2 這些還原當(dāng)量，還原當(dāng)量粒體內(nèi)膜上的 NADH 脫氫酶的作用下，還原性氫、電子與氧氣結(jié)合生成水，能量則以高能磷酸鍵的形式并存在 ATP 中，而氧化后的 NAD+和 FAD 等輔酶則再次進(jìn)入呼吸鏈進(jìn)行循環(huán)1,2,3。1華技 大 學(xué)1.2 腦組織氧化還原狀態(tài)檢測技術(shù)概述對于氧化還原狀態(tài)的研究已經(jīng)了數(shù)個世紀(jì)，從早期對于動物整體氧化還原代謝的研究一直到現(xiàn)物化學(xué)中對于單個氧化還原代謝反應(yīng)機(jī)制的探索。代謝（Metabolism）

19、的概念的出現(xiàn)最早可追溯到 13 世紀(jì)。當(dāng)時人們雖然已經(jīng)開始認(rèn)識到代謝的存在，但是沒有真正揭示氧化還原代謝進(jìn)程的機(jī)制，人們只是普遍認(rèn)為存在一種“活力”可以活化 4,5。直到 19 世紀(jì)，科學(xué)家 Louis Pasteur（路易斯·巴斯德，法國）通過對糖被酵母酵解為 的這種現(xiàn)象的研究才發(fā)現(xiàn)“酵素”6。20 世紀(jì)初，EduardBuchner（愛德華·比希納，德國）將這種“酵素”稱為酶7。這些發(fā)現(xiàn)與科學(xué)家 FriedrichWöhler（弗里德里希·維勒，德國）在 1828 年的關(guān)于尿素的化學(xué)共同證明了細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)和有機(jī)物與其他化學(xué)相同，都遵循化學(xué)的基

20、本原則8。雖然人們已經(jīng)在很早的時候就認(rèn)識到腦的重要性，但是由于技術(shù)的限制和腦組織代謝狀態(tài)本身的復(fù)雜性，使得對于腦組織的氧化還原代謝狀態(tài)的研究起步較晚。先前的研究主要是停留在離體腦組織的生物化學(xué)方面的研究。隨著諸如色譜分析、核磁共振、電子顯微學(xué)、同位素標(biāo)記、質(zhì)譜分析等大量新技術(shù)的應(yīng)用，使得研究者可以發(fā)現(xiàn)并具體分析細(xì)胞中與代謝途徑相關(guān)的。放射自顯影技術(shù)（Radio Autography）可以顯示神經(jīng)細(xì)胞氧化還原代謝變化。通過顯示神經(jīng)細(xì)胞的氧化還原代謝水平的相對變化可以展示神經(jīng)細(xì)胞在特定信息傳遞活動中的作用。放射自顯影優(yōu)點(diǎn)：精確、靈敏度高、分辨率好、能保存相當(dāng)長時間；操作簡便、無需復(fù)雜設(shè)備；可供定量

21、研究和雙同位素示蹤；將形態(tài)和氧化還原代謝的研究統(tǒng)一起來；研究某些大 在體內(nèi)的動態(tài)變化過程9,10。正電子發(fā)射成像（Position Emission Tomography, PET）使用人工引入的放射性氧化還原代謝物質(zhì)。這種放射性氧化還原代謝物質(zhì)被注射入 。PET 設(shè)備檢測氧化還原物質(zhì)在腦內(nèi)衰變時產(chǎn)生的正電子，來產(chǎn)生腦氧化還原圖像。常用的放射性標(biāo)注物質(zhì)是含氟-18 的氯代脫氧葡萄糖11,12。功能性核磁共振成像技術(shù)（Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI）是一種利用血氧水平依賴性（Blood Oxygenation Level Dependent，

22、BOLD）對比結(jié)果來測量動物血氧和血流的方法。fMRI 技術(shù)通過探測反映神經(jīng)組織活動的腦血流量（Cerebral Blood Flow，CBF）以及血氧的變化，間接可以反應(yīng)腦組織氧化還原代謝狀態(tài)。BOLD 響應(yīng)比較復(fù)雜，fMRI 信號形狀變化較大等因素對后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析2華技 大 學(xué)12,13 。和處理帶來了額外的 磁共振波譜技術(shù) (Magnetic ResonanceSpectroscopy Technology, MRS)14,15和波譜成像(Resonance Spectroscopy)16可用于探測腦組織氧化還原代謝物濃度，為病變的早期檢測提供依據(jù)。單光子發(fā)射計算機(jī)斷面成像（Sing

23、le Photon Emission Computer Tomography, SPECT）的基本原理與 PET 相似，但是該技術(shù)檢測的是放射性氧化還原物質(zhì)衰變時產(chǎn)生的伽瑪射線17。與 MRI 相比，PET 和 SPECT 的共同缺點(diǎn)是較低的空間分辨率， 以及對放射性氧化還原物質(zhì)的使用。他們的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以使用不同放射性的外源標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)注氧化還原物質(zhì)，具備一定的靈活性12,13,17。在神經(jīng)科學(xué)氧化還原代謝研究領(lǐng)域，除了上述技術(shù)外，光學(xué)成像技術(shù)越現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，可以實(shí)現(xiàn)在不同的空間層次上和尺度上動態(tài)、離體靜態(tài)測量神經(jīng)生理病理活動情況，其涵蓋范圍從微觀的細(xì)胞行為到集群細(xì)胞網(wǎng)

24、絡(luò)，從局部腦組織及功能回路到宏觀整體的腦功能區(qū)域響應(yīng)18,19。1.3 測氧化還原狀態(tài)的熒光成像技術(shù)熒光成像（Fluorescence Imaging）技術(shù)是光學(xué)成像（Optical Molecular所獨(dú)有的特異性、靈活I(lǐng)maging）技術(shù)的重要組成部分之一，因其成像對象熒光性等特點(diǎn)使之特適合研究生命現(xiàn)象，導(dǎo)致該技術(shù)成為生命科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域快速發(fā)展的一個方向。熒光成像的原理是當(dāng)熒光吸收到一定數(shù)量的激發(fā)光后，將會發(fā)射出比激發(fā)光波長稍長的熒光，再用高通量的帶通濾光片把激發(fā)光和的發(fā)射熒光來，達(dá)到熒光成像之目的20。（發(fā)射光）區(qū)熒光團(tuán)是熒光成像中最小的發(fā)光單元，通過吸收能量被激發(fā)到高能態(tài)，高能態(tài)穩(wěn)定性

25、欠佳又回到低能態(tài)同時能量，這些能量部分以光子的形式發(fā)射出來。其中，激發(fā)指的是在一定的條件下，熒光團(tuán)的電子吸收能量（如光能、電能、熱能、機(jī)械能等，以輻射能為主）后躍遷到較高能級（激發(fā)態(tài)）的過程。但是，由于處于激發(fā)態(tài)的電子往往是欠穩(wěn)定的，它總是要想回到基態(tài)，當(dāng)激發(fā)能量沒有后的一段時間內(nèi)，它將會向基態(tài)躍遷，并將多余的能量出去。躍遷方式既可以輻射躍遷，又可以非輻射躍遷。以非輻射躍遷方式躍遷時，能量多數(shù)轉(zhuǎn)化為熱能，而以輻射方式躍遷的，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)波長的光的過程就是發(fā)射。熒光團(tuán)的激發(fā)正是輻射躍遷的方式，當(dāng)熒光團(tuán)受到入射光（波長為 ex，能量為 hvex）激發(fā)以后，熒光團(tuán)吸收激發(fā)光的能量，躍升至3華技 大

26、 學(xué)高能級，當(dāng)熒光團(tuán)由激發(fā)態(tài)重新躍遷回基態(tài)時，出吸收激發(fā)光的多余能量，這種能量的過程將會放出波長更長的熒光（波長為 em，能量為 hvem）20，如圖 1-1所示。高能級低能級圖 1-1熒光受激發(fā)后發(fā)射熒光過程示意圖20Fig.1-1 The process schematic diagram of the fluorescence-emission after fluorescent molecular stimulated 20目前，大部分熒光探針需要體外成像技術(shù)都是對外源性熒光后標(biāo)記才能識別，而內(nèi)源性熒光進(jìn)行成像，而外源性熒光無需外源性標(biāo)記就可以用于氧化還原代謝狀態(tài)的實(shí)時監(jiān)測21,43。

27、在組織細(xì)胞線粒體整個氧化還原代謝過程之中，需要吡啶核苷酸和黃素蛋白這兩種輔酶進(jìn)行調(diào)節(jié)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NAD+) 或稱輔酶 I（CoI），是氧化代謝中連接作用物與呼吸鏈的重要環(huán)節(jié)1,21,22。如圖 1-2 所示，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD+和還原型腺嘌呤二核苷酸 NADH 在光譜上有巨大差異：NAD+的激發(fā)譜和發(fā)射譜在譜段內(nèi)無明顯差異，呈水平分布，幾乎沒有波譜峰值存在，且熒光強(qiáng)度明顯弱于 NADH；NADH 的激發(fā)譜和發(fā)射譜峰值差異很大，激發(fā)波段在 300 nm -380nm，峰值在 360 nm；發(fā)射波段在

28、 420 nm-480 nm，峰值在 460 nm。由于 NAD+和 NADH 等熒光物質(zhì)的濃度與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，并根據(jù)這些光譜學(xué)性質(zhì)，可通過在 360 nm 附近激發(fā) NADH，并收集 460 nm的多寡 23。的熒光信號，便可根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱熒光4華技 大 學(xué)黃素蛋白（Flavoprotein，F(xiàn)p）種類很多，其輔基有兩種，一種為黃素單核苷酸（Flavin Mononucleotide，F(xiàn)MN），另一種為黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide， FAD），兩者均含核黃素(維生素 B2)1,3,24。黃素蛋白參與呼吸鏈組成，與電子轉(zhuǎn)移有關(guān)。如圖 1-

29、2 所示，氧化型的黃素蛋白和還原型的黃素蛋白在光譜上也有很大差異， 且剛好與吡啶核苷酸相反：還原型的黃素蛋白的光譜的激發(fā)波段和發(fā)射波段幾乎沒有峰值，且熒光信號強(qiáng)度明顯弱于氧化型的黃素蛋白。氧化型的黃素蛋白在激發(fā)波段和發(fā)射波段有明顯的峰值，其激發(fā)波段是 445 nm-470 nm，激發(fā)峰值是 455nm；發(fā)射波段是 490 nm-580 nm，峰值是 520nm。同理，可通過 455 nm 激發(fā)并收集 520 nm 的熒光，再根據(jù)信號強(qiáng)弱黃素蛋白多寡24。圖 1-2氧化型和還原型的吡啶核苷酸和黃素蛋白的激發(fā)譜和發(fā)射譜25Fig 1-2 Excitation spectrum and emissi

30、on spectrum of oxidized and reduced pyridine nucleotide and flavoprotein 25因此，可以利用內(nèi)源性熒光如圖 1-3 所示25。成像技術(shù)檢測動物組織線粒體氧化還原代謝狀況，CO COCOOH + 4NAD+ + FAD + 3H O ¬¾P¾D®H4NADH+FADH+4H+3CO3222LipDHfluorfluor360 ® 460nm460 ® 560nm技術(shù)原理25圖 1-3 檢測兩種輔酶濃度的熒光Fig 1-3 Fluorescent molecules

31、technical principle of detecting coenzyme concentration 255華技 大 學(xué)由于位于組織細(xì)胞線粒體內(nèi)呼吸鏈中的吡啶核苷酸和黃素蛋白在其氧化或者還原狀態(tài)時顯示出不同的光譜特征，故可對各種組織的氧化還原代謝狀況進(jìn)行在體或者離體監(jiān)測。組織中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化還原狀況是 ATP 形成率的一個指示劑。1955 年，Chance 和 William 等通過組織勻漿技術(shù)定義了離體線粒體中氧氣、ADP、底物等代謝中間產(chǎn)物的狀態(tài)22,26。經(jīng)過對大鼠肝臟線粒體懸浮液的 NADH 熒光信號的檢測，表明：熒光信號強(qiáng)度依賴于線粒體中 NADH 的氧化還原代

32、謝狀態(tài)。狀態(tài) 5：當(dāng)線粒體乏氧時，NADH 的熒光信號強(qiáng)度變化不明顯，可理解為 NAD+已經(jīng)全部還原成 NADH，賦值為 1，即 100%。狀態(tài) 4：粒體靜息狀況下獲得的熒光信號較強(qiáng)，接近 99%。狀態(tài) 3：線粒體由靜息轉(zhuǎn)換成活化時，NADH 的熒光強(qiáng)度降低，達(dá)到 53%。狀態(tài) 2：當(dāng)線粒體的底物（還原當(dāng)量）時，NADH 的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，可理解為 NADH 絕大部分被氧化成 NAD+，賦值為 026。如圖 1-4 左側(cè)所示。圖 1-4 離體和在體情況下 NADH 的熒光強(qiáng)度與線粒體代謝狀態(tài)之間的關(guān)系圖26,27Fig. 1-4 The relation diagram between N

33、ADH fluorescence intensity and Mitochondrial metabolic status in vivo and ex vivo 26,27如圖 1-4 右側(cè)所示，1984 年，Mayevsky（麥耶夫斯基，以色列）在大鼠露的大腦皮層上進(jìn)行了在體的 NADH 熒光強(qiáng)度的監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在體 NADH 熒光信號強(qiáng)度是連續(xù)變化的，難以分為幾個階段，與離體檢測不一致的。而與離體結(jié)果一致的是，變化的趨勢是一樣的。在缺血乏氧或者狀態(tài)時，NADH 熒光信號強(qiáng)度最大，類似6華技 大 學(xué)于狀態(tài) 5；低氧、局部缺血乏氧或者局部缺血引起的皮層擴(kuò)散性抑制時，NADH 熒光信號強(qiáng)度有

34、所降低，接近狀態(tài) 4；麻醉或者清醒狀態(tài)時，NADH 熒光信號強(qiáng)度介于狀態(tài) 3 和狀態(tài) 4 之間；在高壓氧、解偶聯(lián)劑等作用或者癲癇發(fā)生時，NADH 熒光信號強(qiáng)度進(jìn)一步下降，接近狀態(tài) 327。1962 年，Chance 及其同事首次露的大腦皮層、腎臟表面和其他多種了使用表面熒光檢測儀器在原位麻醉大鼠暴組織上進(jìn)行的 NADH 熒光信號探測結(jié)果，證明了氧氣對組織中線粒體 NADH 的氧化還原狀況的影響，以及 NADH 氧化還原狀況的變化與大腦皮質(zhì)電活動之間的關(guān)系28,29,30。NADH 熒光強(qiáng)度變化與大腦的活力狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果表明：癲癇等痙攣性行為、直接物理或者化學(xué)刺激皮質(zhì)或者大腦皮層擴(kuò)散性抑制

35、等行為都將引起 NADH 熒光信號強(qiáng)度的瞬間變化，提示 NADH濃度也在瞬間改變31,32。1972 年，Chance 及其同事首次將光纖技術(shù)引入到 NADH 熒光信號強(qiáng)度的檢測中，開始檢測清醒動物腦組織表面或者其他的表面和內(nèi)部的NADH 熒光信號強(qiáng)度33。但是大腦皮層之下乃至整個大腦的氧化還原狀態(tài)在生理或病理過程中如何演變，我們還知之甚少。1985 年，Chance 及 Quistorff 等人設(shè)計和研制的低溫掃描熒光成像系統(tǒng)（HighSpatial Resolution Automated Low-Temperature Redox Ratio Scanning Instrument）一直

36、是研究冷凍組織二維斷面和三維立體氧化還原狀態(tài)成像的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”25。1999 年， Shiino 和 Chance 等人以正常沙鼠為研究對象，應(yīng)用低溫掃描熒光成像系統(tǒng)對沙鼠的大腦進(jìn)行了三維氧化還原比率成像，發(fā)現(xiàn)鼠腦的氧化還原比率在腦組織中存在區(qū)域差異性，并肯定這種區(qū)域差異性來自腦組織本身的氧化還原狀態(tài)的區(qū)域差異性34。2002年，Yueqing Gu 和 Britton Chance 改進(jìn)成像系統(tǒng)，使得其既可以對內(nèi)源性熒光成像，又可以同時對外源性熒光探針進(jìn)行成像，并命名為高分辨率三維掃描光學(xué)成像系統(tǒng)（High-resolution three-dimensional scanning opti

37、cal image system）35。2009 年，HeN. Xu 和 Britton Chance 引入 CCD（Charge-coupled Device，電荷耦合元件）對弱熒光信號進(jìn)行探測，搭建基于 CCD 探測的氧化還原狀態(tài)成像系統(tǒng)（CCD-based redox imager），大大地縮短了成像時間，提高了時間分辨率，降低了液氮的損耗36,37。檢測 NADH 的熒光強(qiáng)度已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于評價組織的代謝狀態(tài)和組織內(nèi)的氧分壓等參數(shù)，但是檢測單個熒光物質(zhì)的信號強(qiáng)度的絕對值存在缺陷，表現(xiàn)在檢測儀器的誤差和組織內(nèi)的其它內(nèi)源性熒光物質(zhì)發(fā)射波段重疊等有可能會引起的誤差。如前文所述可知：氧化型的

38、黃素蛋白的熒光信號強(qiáng)度要高于還原型的黃素蛋白的熒光信號強(qiáng)7華技 大 學(xué)度，而作為氧化還原反應(yīng)中呼吸鏈的另外一種主要輔酶吡啶核苷酸而言，情況則剛剛相反，即還原型吡啶核苷酸的熒光信號強(qiáng)度要強(qiáng)于氧化型吡啶核苷酸的熒光信號強(qiáng)度。作為呼吸鏈中的兩種主要電子傳遞載體，還原型吡啶核苷酸和氧化型黃素蛋白之間的 熒光信號強(qiáng)度的比值正好代表了組織細(xì)胞線粒體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)的還原型電子載 體與氧化型電子載體的比值，這更能客觀反映組織細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)狀況。因此， 很多研究采用的氧化還原比率 NADH/(NADH+Fp)和 Fp/(Fp+NADH)來作為更為準(zhǔn)確直觀地反映組織細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)狀態(tài)的敏感的指標(biāo)25-

39、29。1.4 大樣品低溫速凍技術(shù)概述由于體內(nèi)生化反應(yīng)的速率很快，要固定腦組織氧化還原代謝狀態(tài)，需要較快的速率才能迅速維持氧化還原狀態(tài)在某一時刻不變?？焖俟潭X組織氧化還原代謝的方法有快速降溫固定法（ Rapid Freezing Fixation Technique ）、微波輻射（ Microwave Irradiation）固定法等方法38-41。降溫固定法的原理是通過降低組織的環(huán)境溫度來降低細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的速率達(dá)到固定組織代謝速率之目的。微波輻射固定法的原理是通過升高組織的溫度使得細(xì)胞內(nèi)酶失活而使得胞內(nèi)生化反應(yīng)停止以達(dá)到固定組織代謝狀態(tài)之目的。兩種方法各有利弊，由于固定好的組織會在液氮環(huán)境

40、中保存來維持其被固定的狀態(tài)，加之降溫法的程序比微波加熱法更為簡化、環(huán)保。采用快速降溫固定組織的方法主要是超低溫制冷劑快速冷凍，其目的是完全化（Vitrification）38,39,40。一般而言，液態(tài)物質(zhì)需要被冷卻直至?xí)腥缦聝煞N不相同的方式：第式是需要液體需要經(jīng)過相變。即，液體從液相開始進(jìn)行不連續(xù)的低溫過程，先形成晶體再變成固體；另一類方式是液體完全不需要經(jīng)過液相-固相的相變過程，液體直接可以從液相進(jìn)行連續(xù)不斷地快速低溫成體（仍是化轉(zhuǎn)變38,39,40。液相，但粘度極高）。這個過程就被稱做為雖然說化固體只是一類處于亞穩(wěn)態(tài)的非固相卻了的液體，但是由于化固體的黏度要比一般的液體高約 1015

41、倍，因此在實(shí)用的數(shù)十年的時間范圍內(nèi)，通常被認(rèn)為是穩(wěn)定的。對于不同的液相物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)液體的完全化轉(zhuǎn)化所需要的冷凍速率相差非常大。例如，對于二氧化硅這種物質(zhì)，只要 103 /s 的冷凍速率就可以將 2 m厚的二氧化硅材料實(shí)現(xiàn)整體完全化；而要實(shí)現(xiàn) 3.5 cm 厚的二氧化鍺材料的完全玻璃化，卻只需要 0.35 /s 的冷凍速率。但是對于純水而言，即使高達(dá) 107 /s 的冷凍8華技 大 學(xué)化固體38,39,40。速率也難得到 1 m 的完全化的途徑示意圖38-40圖 1-5 水溶液的補(bǔ)充相圖以及實(shí)現(xiàn)完全Fig.1-5 The aqueous phase diagram and the aqueous

42、glass transition diagram 38-40化的難度非常大。如圖 1-5生物組織都是含水量非常高的系統(tǒng)，要實(shí)現(xiàn)完全所示，給出了常見液相物質(zhì)水溶液的補(bǔ)充相圖。其中，Tm 指的是液相水的凝固溫度；Th 指的是液相水的均相成核溫度；Tg 指的是液相水的化轉(zhuǎn)化溫度。在此，科學(xué)家們已將這個反映液相水溶液的動力學(xué)性質(zhì)的非平衡亞穩(wěn)狀態(tài)數(shù)據(jù)的化溫度加在了相圖之上，故稱之補(bǔ)充相圖或者固液態(tài)圖38,39,40?；D(zhuǎn)目前探索的實(shí)現(xiàn)水溶液化轉(zhuǎn)變的途徑大致有三種38,39,40，將其綜述并列表如表 1-2 所示：化轉(zhuǎn)變的三種途徑38,39,40表 1-1實(shí)現(xiàn)水溶液Table.1-1 Three meth

43、ods to realize the aqueous glass transition 38,39,40途徑方法條件適用對象102-103K/s Tm-Tg>100K避免溶液損失完全化法極高的冷卻速率體積較小的細(xì)胞20%以下的溶液稀溶液部分化法兩步法冷卻先慢速再快速化溶液法化溶液保護(hù)溶液濃度高細(xì)胞、組織無化學(xué)損傷由此可知：對于腦組織這樣的大組織要實(shí)現(xiàn)化，“完全化方法”是不現(xiàn)實(shí)9華技 大 學(xué)的，“兩步冷卻法”和“化溶液方法”是可以嘗試的。但是如果是要快速固定腦組織的氧化還原代謝狀態(tài)，“兩步冷卻導(dǎo)致內(nèi)部組織和外部組織被冷卻的時間存在一定的時間差，當(dāng)外部組織先冷卻后將會導(dǎo)致內(nèi)部組織由于缺血乏氧

44、等導(dǎo)致內(nèi)外組化溶液灌注織代謝而存在較大的實(shí)驗(yàn)操作性誤差；“化溶液方法”需要預(yù)先將到腦組織，考慮到腦屏障和灌注的溶液會引起組織代謝狀態(tài)改變等因素，因而也不適宜固定腦組織代謝狀態(tài)。在目前還不能對腦組織化時，傳統(tǒng)固定腦組織代謝狀態(tài)的方法有：斷首液氮速凍法（Decapitation into Liquid Nitrogen）、液氮直接速凍法（Rapid Freezing the Intact Animal）和漏斗式液氮速凍法（Funnel Rapid Freezing）41。將其綜述并列表如表 1-2 所示：表 1-2 三種固定腦組織代謝狀態(tài)的方法41Table.1-2 Three methods t

45、o fix the tissue metabolic status 41方法優(yōu)勢不足斷首液氮速凍法迅速、廉價組織乏氧自溶無需專業(yè)設(shè)備刺激中樞神經(jīng)液氮直接速凍法操作簡單、成本低層組織乏氧自溶無需任何專業(yè)設(shè)備體重不超過 40g設(shè)備昂貴， 需要麻醉漏斗液氮速凍法持續(xù)供應(yīng)血氧實(shí)時監(jiān)測生理參數(shù)操作復(fù)雜，時間較長1.5本課題的主要研究內(nèi)容本研究基于鼠腦組織乏氧后線粒體中呼吸鏈偏向還原狀態(tài)的特性，性地對線粒體中兩種重要輔酶還原型熒光NADH 和氧化型熒光Fp 進(jìn)行激發(fā)熒光成像，采用搭建的多通道低溫三維熒光顯微成像系統(tǒng)對鼠腦的氧化還原狀況進(jìn)行ex vivo 二維斷層成像。本課題受到自然科學(xué)基金（3080148

46、2），光電實(shí)驗(yàn)室 基金（2009，張智紅）和 111 計劃（B07038）的資助。第一章的緒論中分析了胞內(nèi)糖氧化還原代謝過程以及調(diào)節(jié)組織細(xì)胞線粒體氧化還原反應(yīng)進(jìn)行過程中的兩種關(guān)鍵輔酶 NADH 和 Fp 的物理化學(xué)性質(zhì)，闡述了利用NADH 熒光信號強(qiáng)度評價線粒體氧化還原狀況的意義，提出了采用氧化還原比率綜合10華技 大 學(xué)評價氧化還原狀態(tài)，綜述了腦氧化還原狀態(tài)研究的歷史和進(jìn)展。并分析了采用快速降溫方式樣品的原理和機(jī)制，論述了液氮低溫環(huán)境下快速冷凍腦組織代謝狀態(tài)的三種常見方法及其特點(diǎn)。最后介紹了本文的主要內(nèi)容。第二章介紹了漏斗法、斷首法和直接冷凍法三種液氮低溫環(huán)境鼠腦樣品的方法。通過對三種鼠腦方

47、法和流程、成像結(jié)果的論述，討論并篩選出最佳固定鼠腦組織線粒體氧化還原狀態(tài)的方法。第三章介紹低溫成像環(huán)境的維持技術(shù)方法原理及其實(shí)現(xiàn)過程。本章主要從低溫環(huán)境能夠存在的條件出發(fā)，介紹了低溫環(huán)境實(shí)現(xiàn)的方法，以及低溫下樣品固定模塊、組織樣品代謝狀態(tài)被固定后低溫環(huán)境維持模塊、低溫成像環(huán)境優(yōu)化模塊等低溫環(huán)境各主要組成模塊的設(shè)計及實(shí)現(xiàn)方法。第四章介紹乏氧致死鼠腦及其對照組正常鼠腦在低溫環(huán)境下進(jìn)行顯微熒光成像的過程及其結(jié)果。低溫?zé)晒獾膮^(qū)域差異性。成像技術(shù)探索不同生理狀態(tài)下鼠腦組織氧化還原狀態(tài)第五章對本文內(nèi)容及作者所做的工作進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)介紹了研究內(nèi)容和創(chuàng)新之處，并對本研究的意義和發(fā)展方向進(jìn)行了展望。整個的內(nèi)容

48、和文檔組織結(jié)構(gòu)如圖 1-6 所示。11華技 大 學(xué)第一章：緒論介紹了熒光成像技術(shù)的原理、組織線粒體氧化還原過程及其代謝狀態(tài)的檢測歷史和進(jìn)展、應(yīng)用液氮低溫技術(shù)固定組織代謝狀態(tài)的優(yōu)勢和方法，最后介紹了本 文的主要研究內(nèi)容。第二章鼠腦樣品低溫第三章低溫成像環(huán)境維持方法方法第四章：鼠腦氧化還原狀態(tài)的低溫成像第五章：總結(jié)與展望總結(jié)了本文主要內(nèi)容，并對本研究的意義和發(fā)展方向進(jìn)行了展望。圖 1-6 本文主要內(nèi)容和結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1-6 The main content and the structure schematic drawing12華技 大 學(xué)2鼠腦樣品的低溫方法2.1引言生命體氧化還原代謝過程

49、的實(shí)質(zhì)就是呼吸鏈中電子的傳遞過程，其特點(diǎn)就是電子傳遞速度快，且依賴于輔酶，因此，輔酶的數(shù)量在一定程度上就表征組織的代謝狀況。即，輔酶數(shù)量越多，其代謝的活力越強(qiáng)。某種輔酶越多，組織代謝狀態(tài)的偏向性越加明顯。由于電子的速度極快，組織的氧化還原狀態(tài)也是個極快動態(tài)變化的過程。因此，氧化還原代謝狀態(tài)研究的關(guān)鍵就在于樣品狀態(tài)。時如何迅速固定組織的氧化還原實(shí)驗(yàn)動物樣品是整個研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，是決定整個研究成敗的關(guān)鍵之所在41,42,45,47。而大樣品的氧化還原狀態(tài)的迅速固定是決定整個樣品的氧化還原狀態(tài)均勻固定狀況的前提。因此，需要尋找一種可以迅速固定大樣品的氧化還原狀態(tài)的樣品方法。本章將比較鼠腦模型的斷

50、首法、漏斗法和直冷法三種方法，尋找適合本研究的樣品方法。2.2 固定組織氧化還原狀態(tài)的低溫技術(shù)一般的冷凍實(shí)驗(yàn)樣品的流程是先取材再固定，但是由于本研究是大樣品組織氧化還原代謝狀況而開展的工作，通常的取材操作均會影響組織的代謝狀態(tài)，使其不能接近其生活狀態(tài)，因此本研究需要先固定后取材。通常的固定操作是用乙醛、戊二醛、重鉻酸鉀、升、鋨酸等對組織進(jìn)行浸泡或者灌注，而這些物質(zhì)會對組織的代謝狀況帶來不確定的影響，故本研究不能采用這些化學(xué)固定方式38,42,44。組織氧化還原代謝，是生命活動的一種重要體現(xiàn)形式，歸根到底都是酶催化的一系列生物化學(xué)反應(yīng)，其本質(zhì)就是電子的得失。要想固定組織的氧化還原代謝過程，首當(dāng)其

51、沖就需要降低電子的速率，即，使得組織細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)速率降低甚化學(xué)獎獲得者 Svante August Arrhenius （斯范至完全停止。著名物理化學(xué)家特·奧古斯特·阿累尼烏，瑞典）在長期研究溫度對化學(xué)反應(yīng)速度的影響后，得出Arrhenius 關(guān)系式38：13華技 大 學(xué) Ea（2-1）k = A · eR T其中 k 是化學(xué)反應(yīng)速率；R 是氣體常數(shù)，約為 8.314 kJ/(Kmol·K)；T 是絕對溫度；Ea 是活化能；A 是 Arrhenius 因子，對于給定的反應(yīng)，A 是個常數(shù)。由 Arrhenius 關(guān)系式可知：化學(xué)反應(yīng)速率與其活化能的

52、大小和溫度的高低密切相關(guān)，活化能越低，反應(yīng)速率越快，因此降低活化能會有效地促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。酶通過降低活化能（實(shí)際上是通過改變反應(yīng)途徑的方式降低活化能）來促進(jìn)一些原本很慢的生化反應(yīng)得以快速進(jìn)行。一般而言，溫度可以影響酶的活性。高溫使得酶失活，低溫使得酶的催化效應(yīng)被抑制。酶催化效應(yīng)的降低勢必將導(dǎo)致活化能的升高，并將進(jìn)一步降低氧化還原反應(yīng)的速率。根據(jù) Arrhenius 關(guān)系式（2-1）計算，可以得到生化反應(yīng)速率與溫度的關(guān)系，即可以得到生物氧化還原速率與溫度的關(guān)系38。如表 2-1 所示。表 2-1 溫度與氧化還原代謝率關(guān)系表38Fig.2-1 Relation table of temperatu

53、re and redox metabolic rate 38氧化還原代謝率的比率溫度（）等量代謝物被消耗時間（相對液氮環(huán)境下）7.8×10143.6×10141.5×10142.7×10121.7×1095.8×105137（體溫）20（室溫）0（冰點(diǎn)）-65（冷凍切片機(jī)）-128（四氟化碳凝固點(diǎn)）-164（甲烷沸點(diǎn)）-196（液氮沸點(diǎn)）1 s2.15 s5.19 s4.85 min5.21 days42.71 years 2.46×1010 years如某一生物體的代謝底物在 37 環(huán)境下可以代謝 1 秒鐘，假定其代謝速率

54、在液氮環(huán)境下為 1。那么根據(jù)理論計算，該生物體在 37 下的代謝速率是液氮環(huán)境下的7.8×1014 倍，同樣多的物質(zhì)在液氮環(huán)境下需要 2460 萬年才能代謝完。根據(jù) Arrhenius 關(guān)系式，通過低溫技術(shù)，可以將生物組織的物質(zhì)代謝和氧化還原14華技 大 學(xué)代謝固定在冷凍前的一刻，這是低溫成像技術(shù)的一個優(yōu)勢。低溫是物理學(xué)上的一個概念，在引入到生物和醫(yī)學(xué)后，其所覆蓋的溫度范圍變寬泛了，包括從稍低于正常體溫（37 ）直到低于 4 K（-269 ），如低體溫醫(yī)療技術(shù)的溫度一般是稍微低于 37 ，動植物耐寒性研究中的低溫范圍在 0 左右，而組織低溫保存、腫瘤低 割技術(shù)的低溫范圍卻需要低至-19638-40。低溫技術(shù)，一是需要一個低溫環(huán)境，二是需要合適的制冷劑。低溫環(huán)境的構(gòu)建關(guān)鍵在于絕熱，這個問題將在第三章系統(tǒng)分析。在此只分析制冷劑。低溫技術(shù)中根據(jù)所需低溫環(huán)境的溫度值和樣品所需的溫度值，有很多種制冷工質(zhì)可供選擇38。表 1-1 列舉了常見的幾種制冷工質(zhì)及其物理參數(shù)。表 2-2常見制冷工質(zhì)凝固點(diǎn)和沸點(diǎn)表38Table.2-2 Common refrigerant freezin