1、實用標準文案銀杏葉中銀杏黃酮大孔樹脂吸附分離性能的研究近年來，整個世界特別是西方發達國家掀起了一陣綠色浪潮。國際上漸漸形 成了一種共識-得自綠色生命(植物)的產品往往具有較大的安全性。銀杏作為近 代植物藥開發研究的熱點之一，正處于這一浪潮的前沿。銀杏樹為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba.L.)又名公孫樹，為我國特產植物. 銀杏葉提取物(GRE)主要含黃酮，內酯兩類活性成分，黃酮以山柰酚(kaempferal), 槲皮素(quercetin),異鼠李素(isorham netin)的甙類化合物為主,內酯以白果內 酯及銀杏內酯A.B.C(gimkgolide ABC)為主。銀杏黃酮具有捕

2、獲游離基,抑制血 小板活化因子(PFA)擴張冠動脈血管,增加心腦血量等功效?？捎糜谥委熡捎谘?老化，腦血管供血不足所導致的外周循環不良眩暈耳鳴頭痛失眠,短期記憶不良 聽力障礙,精神不振等,同時,還可以用于研制營養口服液，保健食品與化妝品，其應 用日益廣泛有關銀杏提取方法報道很多，德國首先提出銀杏制劑含量的質量標準: 黃酮糖甙24%萜內酯6%和白果酸2 X10-6。為了是銀杏產品能出口創匯，參 加國際市場的大循環，不斷探索新的提取方法工藝,研究并選擇出簡單且高效的工 藝方法以成為這個領域的焦點。目前有關銀杏葉的提取工藝主要以乙醇為提取溶劑，由于乙醇系有機溶劑， 消耗大、成本高、且生產過程存在易

3、燃等安全隱患，為此我們根據銀杏葉異黃酮 有一定的水溶性，試改用水做提取溶劑，以銀杏黃酮為目標，對其銀杏黃酮進行 了正交提取工藝研究，并對最佳提取工藝得到的提取液進行了大孔吸附樹脂吸附 分離性能研究，以期為銀杏葉銀杏黃酮的開發利用提供依據。1材料與儀器1.1材料 銀杏葉（采自陜西略陽），自然干燥，粉碎。1.2試劑銀杏黃酮對照品（含量98%）:購自Sigma公司;大孔樹脂LX-38、LX-1、D101 , AB-8購自西安藍小科技開發有限公司。試劑均為分析純。1.3儀器電熱恒溫水浴鍋（H H S21-6C ,上海醫療器械五廠）;電子分析天平 （FC204，上海精科實業有限公司）;UV -762紫外

4、分光光度計（上海精密科學儀器 有限公司）;旋轉蒸發器（上海亞蓉生化儀器廠）；SHZ-D（川）循環水式真空泵，索式 提取器，電熱鼓風干燥箱；植物粉碎機（FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司）2方法2.1銀杏葉銀杏黃酮、銀杏內酯的薄層檢測銀杏葉銀杏黃酮的薄層檢測硅膠薄板制作稱取4g硅膠G置于研缽中，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液12ml，研磨15min后鋪于20 X10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無氣泡，然后晾干即可。 展開劑配制取展開劑氯仿-甲醇-乙酸乙酯按2: 1 : 1的比例配制60ml （30 : 15 : 15） 作為展開劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在105 °C下活化3

5、0min 。點樣：點樣點距板子底端1.5cm左右，所有點樣點位于同一直線上，盡可能向中間靠攏，每個點樣點點樣約20訕，點樣點盡可能小。飽和：將板子不沒入層析缸內的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約0.5h。層析：將板子下端插入展層劑中進行展開，當展層劑前沿距板子上端約1.5cm 時取出板子，自然晾干。觀察：展開取出晾干后，噴5%Alcl3的乙醇溶液，熱風吹干、并在365nm熒光燈 下觀察。Rf 。銀杏葉銀杏內酯的薄層檢測硅膠薄板制作稱取4g硅膠G或硅膠GF254置于研缽中，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶 液12ml，研磨15min后鋪于20 X10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無氣泡， 然后晾干

6、即可。展開劑配制取展開劑甲苯-丙酮按7: 3的比例配制50ml (35 : 15)作為展開劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在105 °C下活化30min。點樣：點樣點距板子底端1.5cm左右，所有點樣點位于同一直線上，盡可能向 中間靠攏，每個點樣點點樣約20訕，點樣點盡可能小。飽和：將板子不沒入層析缸內的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約0.5h。層析：將板子下端插入展層劑中進行展開，當展層劑前沿距板子上端約1.5cm時取出板子，自然晾干。觀察：先噴細水霧定位后170C加熱30分鐘，若有銀杏內酯存在，在波長254nm 下出現蒼黃色熒光斑點，銀杏內酯B的Rf=0.23左右。2.2絡合分光光

7、度法測定銀杏黃酮的含量a.標準曲線的制備精確秤取蕓香葉甙rutin （蘆?。?0mg,用30%乙醇溶液溶解并定容至 100ml （含量為0.30mg/ml）分別吸取標準液1、3、5、7、9ml于25ml容量 瓶中，用30%乙醇補充至12.5ml，加入0.7mlNaNo2（1:20）,搖勻，放置5分鐘后, 加入0.7mlAI（N 03）3（1:20）,6分鐘后加入5ml 1mol/L的NaoH溶液并搖勻，用 30%的乙醇補充至刻度線,10分鐘后于510nm進行比色測定。用UV-265可記錄分光光度計測定結果如下毫升013579濃度值(m g/m l)00.0120.0360.0600.0840.

8、108OD值b.樣品的制備及測定準備稱取2克銀杏葉粉碎至粉末，放置于索氏提取管中。加約150ml甲醇熱 回流至回流液無色，減壓濃縮至小體積、定容至150ml，搖勻待測，從中移取 5ml到25ml中的容量瓶中，按標準曲線的測定方法加樣，并用UV-265紫外分 析儀測定其濃度。精確產品50mg，用30%乙醇溶液溶解并定容至100ml。結果標準曲線如下:測定結果:2.3大孔樹脂靜態吸附實驗表1吸附樹脂的物理性能型號極性比表面積/(m2/g)孔徑/nmLX-38LX-1D101AB-82.3.1樹脂的處理和再生:將樹脂放入蒸餾水中，溶脹后浮選，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用 蒸餾水洗至中性，

9、然后用0.5moL/L的HCI溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至中性。 用95%乙醇浸泡24h，不斷攪拌，用蒸餾水洗至無白色混濁，并且無醇味。用 蒸餾水浸泡待用。樹脂簡單再生可用含量為 95%的乙醇洗至無色，即可使用，經多次使用的 樹脂吸附雜質較多，顏色較深，可用酸堿處理再生后使用。232銀杏葉樣液制備稱取銀杏葉100g，加600ml 75% 酒精超聲提取30min，用4層紗布粗濾 得粗濾液，殘渣再加入500ml75%酒精超聲提取30min ,用4層紗布粗濾得粗 濾液，合并兩次粗濾液，在用濾紙或離心過濾得銀杏葉提取液。銀杏葉提取液減壓濃縮至無醇味，加 65 C溫水至400 ml進行水沉，靜置 過夜，次

10、日下層為油狀膏子保留備檢，上層液過濾并定容至 400 ml，得銀杏葉 樣液( g/ml )。2.3.3飽和吸附量的測定準確稱取經預處理的用濾紙吸干表面水分的樹脂1.00 g于100 ml三角瓶中，精密加入 mg/ml的銀杏葉銀杏黃酮溶液 20.0 ml，在25 °C, 120 r/mi n 的條件下振蕩吸附18-24 h。測定吸附后溶液中銀杏黃酮的量，并按下式計算樹脂的飽和吸附量。飽和吸附量=（加入的銀杏黃酮-未吸附的銀杏黃酮”樹脂的量。2.3.4樹脂脫附率的測定將上述經過24 h靜態吸附銀杏黃酮的樹脂分離出來，吸干表面水分，然后 加入70%的乙醇20.0 ml，在25 C，120

11、r/min的條件下振蕩脫附2 h。測定 脫附液中銀杏黃酮的量，按下式計算脫附率。脫附率（）=洗脫出的銀杏黃酮/（加入的銀杏黃酮-未吸附的銀杏黃酮）X 100%。不同樹脂對銀杏黃酮的吸附量和解吸實驗結果見表。表大孔樹脂靜態吸附及解吸性能型號吸附量/（mg/g）解吸率/%LX-38LX-1D101AB-8從表 可看到4種樹脂中 樹脂的吸附量最大， 最小，在實際生產應 用中，對樹脂要求不僅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保證有效成分的 最大回收。在這2種樹脂中 樹脂不僅具有大的吸附量，而且具有較高的解吸 率，因此認為 樹脂是富集純化銀杏黃酮較為理想的吸附材料。235大孔吸附樹脂解吸特性的考察按2

12、33項的方法得到吸附飽和的樹脂5份,分別精確加入20 mL的15%、30%、45%、60%和75%的乙醇溶液進行解吸，計算不同濃度乙醇溶液對 銀杏黃酮的解吸率。選擇洗脫劑不僅要求具有使大孔樹脂溶脹，減弱被吸附物質與樹脂之間的吸 附力，而且要求可溶解被吸附物質，本實驗選用洗脫劑為乙醇，考察不同乙醇溶 液濃度對銀杏黃酮的解吸效果，結果見圖1。洗脫劑濃度15%30%45%60%75%解吸率%將表做圖圖洗脫劑濃度對銀杏黃酮解吸的影響由圖 可以看出，15%和30%的洗脫液解吸率較低，而60%的洗脫液基本 上可以將銀杏黃酮完全從樹脂上解吸下來，從純化的純度角度和節約試劑用量的 角度考慮，應選用60%乙醇作

13、為洗脫劑，沒有必要使用75%的乙醇作為洗脫劑。 2.3.6 pH對樹脂吸附效果的影響準確稱取預處理好的用濾紙吸干表面水份的濕樹脂5份，每份1.0 g，裝入50mL具塞錐形瓶中，分別加入用2mol/L的鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調節 pH值的溶液20mL，在搖床上振搖18-24 h，測定吸附后溶液中銀杏黃酮的量。pH值3.54.55.56.57.5吸附量將表做圖由圖 可以看出,pH值在4.5-5.5之間,樹脂對銀杏黃酮的吸附量是最大的, 因為銀杏葉黃酮類化合物分子中含有酚羥基、羧基，呈弱酸性，酸性化合物在酸性溶液中易吸附；此外，酸性條件下有利于葡萄糖苷型異黃酮水解成苷元型，更容易被樹脂所吸附。酸

14、性太強，樹脂的吸附性能會受到影響，吸附率下降堿性增強，會使 異黃酮的親水性增強，從而使吸附量下降。2.4大孔樹脂動態吸附實驗2.4.1動態吸附透過曲線的測定吸附材料選取樹脂，采用16 mm X300 mm的玻璃層析柱作為吸附柱，稱取預處理好的樹脂20 g，濕法裝柱，取銀杏葉樣液（g/ml ） 300mL，用2mol/L的鹽酸將黃酮供試液調 pH值為進行上樣，上樣流速控制在2 3 mL/min，每50 mL接一管，測定流出液中銀杏黃酮濃度，繪制動態吸附透過曲 線。流出液體積ml50100150200250300流出液濃度mg/ml將表做圖由圖 可以看出，當上樣液體積達到100mL時,原料液中銀杏

15、黃酮開始透過 樹脂柱，當體積達到200mL時，樹脂柱達到飽和吸附。2.4.2動態脫附解吸曲線測定稱取預處理好的樹脂20 g，濕法裝柱，用2mol/L的鹽酸將銀杏黃酮供試液調pH值為 進行上樣，上樣流速控制在2-3 mL/min ，上樣量為300 mL， 上樣結束后用200mL的蒸餾水進行洗滌，以除去水溶性雜質，然后用75%的乙 醇進行洗脫，每50mL接一管，測量流出液中銀杏黃酮濃度，繪制動態脫附解吸線洗脫劑體積ml20406080100120流出液濃度mg/ml將表做圖由圖 可以看出，用100 mL 75%的乙醇進行洗脫，可基本上將銀杏黃酮完全 解吸下來，洗脫峰集中、對稱，無明顯拖尾現象，起到了很好的富集和回收的作用。 2.4.2洗脫產物中銀杏黃酮純度的測定(由上述實驗確定方案)分別用45%、60%和75%的乙醇作為洗脫劑，按前面的做法裝柱、上