1、 PCR產物的膠回收分離純化 一、實驗儀器1、瓊脂糖凝膠電泳系統2、紫外觀察分析儀3、離心機4、單面刀片5、恒溫水浴鍋二、試劑1、 DNA回收試劑盒2、50×TAE3、ddH2O3、 步驟1 在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖放入1.5ml離心管中。4. 稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以 1 mg=1 l 進行計算。 5. 向膠塊中加入膠塊融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表： 凝膠濃度 DR-I Buffer 使用量 1.0 3 個凝膠體積量 1.01.5 4 個凝膠體積量 1.52.0 5 個凝膠體積量 6. 均

2、勻混合后 75加熱融化膠塊（低熔點瓊脂糖凝膠只需在 45加熱）。此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約 610 分鐘）。注）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響 DNA 的 回收率。 7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的 DR-II Buffer，均勻混合。當分離小于 400 bp 的 DNA 片段時，應在此溶液中再加入終濃度為 20% 的異丙醇。 8. 將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 9. 將上述操作 7 的溶液轉移至 Spin Column 中，12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄濾液。 注）如將濾液再

3、加入 Spin Column 中離心一次，可以 提高 DNA 的回收率。 10. 將500 l的漂洗液Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 離心 30 秒鐘，棄濾液。 11. 將700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 離心 30 秒鐘，棄濾液。注）請確認Rinse B中已經加入了指定體積的100%乙醇。 12. 重復操作步驟 11。 13. 將 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的離心管上，在 Spin Column 膜的中央處加入 25 l 的滅菌蒸餾水或 Elution Buffer，室溫靜置 1 分鐘。注）

4、把滅菌蒸餾水或 Elution Buffer 加熱至 60使用時有利于提高洗脫效率。 14. 12,000 rpm 離心 1 分鐘洗脫 DNA。將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20。15 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物。 制備 ：溶膠液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚紅少許 洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇 存儲液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0). 注意事項1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。2. 切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3. 關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用點marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進行切膠。4. 按照正常程序點marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收