1、細(xì)菌的生理學(xué)細(xì)菌的生理學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備細(xì)菌的接種技術(shù)和培養(yǎng)方法細(xì)菌代謝產(chǎn)物的測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)情況的觀察目的要求目的要求l了解培養(yǎng)基的概念、基本成份、制備過(guò)程、種類及用途。l掌握細(xì)菌的純種分離培養(yǎng)技術(shù)和不同種類培養(yǎng)基接種法。l了解常用細(xì)菌培養(yǎng)法及培養(yǎng)結(jié)果的觀察與描述方法。l掌握細(xì)菌常見的生化反應(yīng)的原理、操作方法及結(jié)果觀察法。一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備（示教）一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備（示教）1.培養(yǎng)基的概念：培養(yǎng)基是用人工方法，將多種物質(zhì)按照各類微生物生長(zhǎng)繁殖所需要而配制的一種混合營(yíng)養(yǎng)料。 2.培養(yǎng)基 的制備過(guò)程l以牛肉膏湯培養(yǎng)基為例（液體）成分：牛肉膏3克蛋白胨10克氯化鈉5克蒸餾水1000

2、毫升調(diào)配加熱融化過(guò)濾調(diào)pH分裝高壓滅菌無(wú)菌檢測(cè)冰箱備用肉湯培養(yǎng)基l取1000毫升肉浸液，加入10克蛋白胨和5克氯化鈉 經(jīng)上述步驟制成。l其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較牛肉膏湯要高。l但因肉浸液制作煩瑣，而牛肉膏湯培養(yǎng)基制作簡(jiǎn)單，故常用。肉湯瓊脂固體、半固體培養(yǎng)基l瓊脂：屬于凝固劑，其化學(xué)成份主要是酸性多糖。其特點(diǎn)是當(dāng)溫度達(dá)到98以上可融化于水，45以下則凝固。l肉湯瓊脂半固體培養(yǎng)基：取100毫升pH7.8的肉湯或牛肉膏湯培養(yǎng)基加入加入0.30.5瓊脂制成。 l肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基：取100毫升pH7.8的肉湯或牛肉膏湯培養(yǎng)基加入23克的瓊脂制成。 3.培養(yǎng)基的種類l按照培養(yǎng)基的物理性狀可分為液體，固體和半固體三類

3、。l按照培養(yǎng)基的用途可分為五類。l按照培養(yǎng)基的組成成分分為三類。 各種培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基固體基斜面半固體厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基4.培養(yǎng)基的用途l傳染病病原的診斷和鑒定l細(xì)菌學(xué)研究l生物制品的制備l菌種的保存l制造各種產(chǎn)品l基因工程中的應(yīng)用二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù) l大多數(shù)細(xì)菌都可用人工的方法進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)繁殖，以便進(jìn)一步觀察和研究各種生物學(xué)特性。培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，根據(jù)研究的目的和細(xì)菌生長(zhǎng)的需要，要采用不同的接種技術(shù)和培養(yǎng)方法。l接種技術(shù)一般分為分離培養(yǎng)法和純種細(xì)菌接種法 （一）分離培養(yǎng)法（一）分離培養(yǎng)

4、法l細(xì)菌分離培養(yǎng)的目的是獲得純種（單個(gè)菌落）。l分離培養(yǎng)成純種菌的方法有平板劃線法、傾注平板法和動(dòng)物接種分離法等，其中以劃線法最為常用。 1平行劃線法：l標(biāo)記l涂基線l劃線l劃線完畢，將瓊脂平板培養(yǎng)基復(fù)蓋皿蓋，并在培養(yǎng)皿底玻璃上，用筆蠟注明接種菌名、接種者姓名及班級(jí)、日期等，將培養(yǎng)皿倒置放在孵育箱培養(yǎng)，以避免培養(yǎng)過(guò)程中凝結(jié)水自皿蓋滴下。平行劃線法的示意圖l見圖2-2A B是最常使用的、最基本的方法，其中圖B常用于含菌量較少的標(biāo)本。2分區(qū)劃線法：l基本步驟與平行劃線法相同，不同之處是在每次劃線前要燒灼接種環(huán)，以殺滅環(huán)上留剩的菌液。l如圖2-3C、D和圖2-4E所示，用于含菌量較多的標(biāo)本。l本次試

5、驗(yàn)要求同學(xué)首先掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)的平行劃線法。圖2-3 分區(qū)劃線法示意圖 l 三段分區(qū)法 四段分區(qū)法 五段分區(qū)法孵育后情況【實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察記錄【實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察記錄】細(xì)菌生長(zhǎng)情況的觀察l觀察瓊脂平板表面生長(zhǎng)的各種菌落，注意其大小、形 狀、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度、顏色等性狀。 單菌落（單菌落（clone)菌落（菌落（R型）型）菌苔菌苔(lawn)細(xì)菌的群體形態(tài)細(xì)菌的群體形態(tài)1、細(xì)菌菌落的特征一般都較小，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，用接種針容易挑起，多數(shù)表面較光滑、濕潤(rùn)、較粘稠，易挑取，質(zhì)地均勻，色澤多樣。細(xì)菌菌落特征：常見的平面正面圖細(xì)菌菌落特征：剖面圖2、菌落的三個(gè)類型：、菌落的三個(gè)類型：1.光滑型菌落（

6、Smooth type Colony） ：又稱S型2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又稱R型3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又稱M型菌落（菌落（S型）型）culture plate菌落(R型)3、影響菌落形態(tài)的因素、影響菌落形態(tài)的因素各種微生物在一定條件下形成的菌落，其形態(tài)特征有一定的穩(wěn)定性和專一性，因而可以作為識(shí)別、鑒定菌種的一個(gè)依據(jù)，但也受某些因素的影響，觀察時(shí)應(yīng)加以注意。1、鄰近菌落、鄰近菌落2、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間3、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基成分4、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)溫度（二）細(xì)菌純種接種法1.斜面培養(yǎng)基接種法2.液體培養(yǎng)基接種法3.半固體培養(yǎng)基穿刺接種法

7、 取菌的方法斜面接種法及接種后菌落生長(zhǎng)示意圖接種后菌落生長(zhǎng)示意圖菌苔(lawn)液體培養(yǎng)基接種法半/固體瓊脂培養(yǎng)基種接法 液體培養(yǎng)時(shí)的群體形態(tài)液體培養(yǎng)時(shí)的群體形態(tài)：穿刺培養(yǎng)的生長(zhǎng)特征（三）細(xì)菌的培養(yǎng)方法（三）細(xì)菌的培養(yǎng)方法l一般培養(yǎng)法 l二氧化碳培養(yǎng)法 l厭氧培養(yǎng)法 三、細(xì)菌常見的生化反應(yīng)結(jié)果觀察（一）單糖發(fā)酵試驗(yàn)【材料】 1菌種：大腸桿菌、乙型副傷寒桿菌和痢疾桿菌斜面培養(yǎng)物。2培養(yǎng)基：葡萄糖、乳糖半固體發(fā)酵管。【方法】 半固體穿刺接種法 【結(jié)果觀察】l在半固體發(fā)酵管中，如細(xì)菌分解這種糖，則指示劑改變顏色，如還能產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基中有氣泡形成。l產(chǎn)酸者用“+”表示，l產(chǎn)酸又產(chǎn)氣用“ ”表示，l不分

8、解者用“”表示。（二）（二）IMViC試驗(yàn)試驗(yàn)【材料】 菌種：大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌的1824小時(shí)斜面培養(yǎng)物。 培養(yǎng)基： 蛋白胨水培養(yǎng)基。 葡萄糖、磷酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基。 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)1.吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn) 原理原理：測(cè)細(xì)菌有無(wú)色氨酸酶 方法方法：分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于2支蛋白胨水培養(yǎng)基中。37孵育48小時(shí)后取出，每管加23滴吲哚試劑于液面上，在接觸面呈玫瑰紅色（環(huán)狀）者為陽(yáng)性，仍呈黃色者為陰性。 2.甲基紅試驗(yàn) 原理原理：測(cè)定細(xì)菌分解葡萄糖后，培養(yǎng)物中的最后酸堿度。方法方法：分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌于2支葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中。37孵育23天后取出，分別滴加甲基紅試劑23滴，可

9、立即觀察，陽(yáng)性者呈紅色，陰性者呈桔黃色。3.Voges-Proskauer二氏試驗(yàn) （簡(jiǎn)稱VP試驗(yàn)） 原理原理：某些細(xì)菌能分解葡萄糖，并使產(chǎn)生丙酮酸發(fā)生脫羧反應(yīng)。 方法方法：分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌于2支2毫升葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中，孵育后分別加入1毫升KOH和一萘酚溶液搖勻，震蕩10分鐘，出現(xiàn)紅色者，為陽(yáng)性反應(yīng)。4.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 原理原理：測(cè)定細(xì)菌能否利用枸櫞酸鹽作為碳的唯一來(lái)源。 方法方法：分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于2支枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上。孵育后觀察，有菌苔出現(xiàn)，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钏{(lán)色，構(gòu)櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性；細(xì)菌不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色不變者，為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性。（三）硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)（三）硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn) 原理原理：測(cè)定細(xì)菌能否分解培