1、?植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)?教案主講：陳發(fā)菊李曉玲易飛一、本課程的性質(zhì)、地位和作用植物組織培養(yǎng)是以植物細(xì)胞、組織、器官為研究對象，運(yùn)用工程學(xué)原理，利用人工培養(yǎng) 基按照預(yù)定目標(biāo)，對植物的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，改變生物性狀，生產(chǎn)生 物產(chǎn)品，為人類生產(chǎn)和生活效勞的一門綜合性技術(shù)科學(xué)， 也是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)之一。 在植物的優(yōu)良品種快速繁殖、 脫毒苗木生產(chǎn)、 縮短育種進(jìn)程、 種質(zhì)資源保存等方面具有其它 技術(shù)無法比較的優(yōu)勢。它的主要研究內(nèi)容是研究在無菌及離體條件下，細(xì)胞、組織、器官所需營養(yǎng)條件和環(huán)境 條件；細(xì)胞、組織、器官的形態(tài)發(fā)育規(guī)律，植物材料的快速大量繁殖方法；原生質(zhì)體融合方 法與機(jī)理；

2、 再生個(gè)體的遺傳變異； 種質(zhì)資源的離體保存機(jī)理與方法； 通過植物細(xì)胞工程實(shí)現(xiàn) 對動植物的遺傳改造 , 創(chuàng)造新的生物種質(zhì) , 為人類造福。二、教學(xué)目的及要求 了解植物組織培養(yǎng)的開展概況、開展現(xiàn)狀、未來開展趨勢及在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。 理解植物組織培養(yǎng)的根本原理。 了解植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室或商業(yè)性種苗生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。熟悉培養(yǎng)室常用儀 器、設(shè)備及用具，并掌握其使用方法，熟知組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用藥品，并掌握其性質(zhì)、用途 及配制方法。 了解植物組織培養(yǎng)中如洗滌、 滅菌、培養(yǎng)基配制、 無菌操作等技術(shù)環(huán)節(jié)，并掌握其操 作規(guī)程，會熟練操作。 了解影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件。 掌握植物器官、愈傷組織、胚胎、花藥與

3、花粉、細(xì)胞、原生質(zhì)體培養(yǎng)及種質(zhì)資源保存 的根底技術(shù)。 掌握植物組培快繁及脫毒苗培育技術(shù)。熟知外植體初代培養(yǎng)、誘導(dǎo)增殖、壯苗與生根及瓶苗馴化等各技術(shù)環(huán)節(jié)，并了解組織培養(yǎng)中污染、褐變及超度含水態(tài)苗發(fā)生的原因及控制 措施。 了解重要植物的組培快繁與脫毒技術(shù)及組培苗工廠化生產(chǎn)與經(jīng)營管理。三、內(nèi)容與課時(shí)安排24學(xué)時(shí)章節(jié)目錄課堂講授內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配表章節(jié)內(nèi)容學(xué)時(shí)第1章概述2第2章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)4第3章愈傷組織培養(yǎng)2第4章胚狀體發(fā)生2第5章器官培養(yǎng)2第6章花藥和花粉培養(yǎng)2第7章細(xì)胞培養(yǎng)2第8章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交2第9章植物脫毒技術(shù)3第10章組培苗工廠化生產(chǎn)的經(jīng)營與管理11第11章種質(zhì)

4、保存2-第1章概 述2學(xué)時(shí)-一一植物組織培養(yǎng)的概念二植物組織培養(yǎng)的開展三植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用本章小結(jié)目的要求：1掌握組織培養(yǎng)的概念和類型;2掌握組織培養(yǎng)的特點(diǎn)；3了解組織培養(yǎng)開展史；(4) 初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實(shí)踐上的應(yīng)用。一、植物組織培養(yǎng)的概念(一) 植物組織培養(yǎng)的概念高等植物的組織培養(yǎng)(tissue culture)技術(shù)是指別離一個(gè)或數(shù)個(gè)體細(xì)胞或植物體的一部 分在無菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。 通常我們所說的廣義的組織培養(yǎng)， 是指通過無菌操作別離植物 體的一局部(即外植體explant)，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完 整的植株。(二) 植物組織培養(yǎng)的生理依據(jù)細(xì)胞全能性 (c

5、ell totipotency) ：植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并 具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于植物細(xì)胞組織的分化和決定具有關(guān)鍵性作用。 它包括：生長素類、 細(xì)胞分裂素類、赤霉素、脫落酸、乙烯等生長素類主要用于愈傷組織的形成， 體細(xì)胞胚的產(chǎn)生及試管苗的生根。 常用的有 2,4-D 、 NAA、 IBA、IAA 等。其作用強(qiáng)弱為 2,4-D>NAA>IBA>IAA。細(xì)胞分裂素類那么有促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化， 延遲組織的衰老，促進(jìn)芽的產(chǎn)生等作用。 常 用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用強(qiáng)弱順序?yàn)椤ip>KT>6-BA>

6、;ZT。赤霉素那么有促進(jìn)已分化的芽伸長生長，打破種子休眠的作用。常用的為GA3。(三) 植物組織培養(yǎng)的類型組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對象可分為組織或愈傷培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、植株培養(yǎng)、細(xì)胞和原生質(zhì)體培 養(yǎng)等。1組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissue, callus culture)為狹義的組織培養(yǎng)，是對植物體的各部 分組織進(jìn)行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁 組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)， 二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。2. 器官培養(yǎng)(organ culture)即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同，可以包括 別離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣

7、、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實(shí) 等外植體的培養(yǎng)3. 植株培養(yǎng)(plant culture )是對完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。4 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture )是對由愈傷組織等進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分 散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。5.原生質(zhì)體培養(yǎng) ( protoplast culture )是用酶及物理方法除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)是本世紀(jì)開展起來的一門新技術(shù)， 由于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步， 尤其是外源激素的應(yīng) 用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學(xué)科提出了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且一躍成為一種大規(guī)模、批量工廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在生產(chǎn)上

8、越來越得到廣泛的應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)之所以開展如此之快， 應(yīng)用的范圍如此之廣泛， 是由于具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： 培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長，擺脫了大自然中四季、 晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響， 且條件均一， 對植物生長極 為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。 生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件， 根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同 的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往 20-30d 為一個(gè)周期。所以，雖然 植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗， 但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)， 故總

9、體來 說本錢低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激 素等條件， 極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)， 也利于自動化控制生產(chǎn)。 它是未來農(nóng)業(yè) 工廠化育苗的開展方向。 它與盆栽、 田間栽培等相比省去了中耕除草、 澆水施肥、 防治病蟲 害等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。二 、植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的開展 植物組織培養(yǎng)的研究可以追溯到 20 世紀(jì)初期，根據(jù)其開展情況，大體可以分為三個(gè)時(shí) 期。1萌芽階段組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃開展只是近 50年的事，但它的

10、整個(gè)歷史可以追溯至 19 世紀(jì)末和上 世紀(jì)初。20世紀(jì)初，在Schleiden和Schwann所開展起來的細(xì)胞學(xué)說的推動下， 1902年德 國植物學(xué)家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和組織為許多細(xì)胞組成的觀點(diǎn)， 以及植物細(xì)胞 全能性的理論， 即植物的體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛在能力。他首次發(fā)表了植物離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的報(bào)告。1912年，Habefiandt的學(xué)生Kotte和美國的 Robins 在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。 Kotte 采用了無機(jī)鹽、葡萄糖、蛋白 胨、天冬酰胺，及添加各種氨基酸的培養(yǎng)基。 Robins 用含無機(jī)鹽、葡萄糖或果糖

11、的瓊脂培 養(yǎng)基，培養(yǎng)了長度為1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的莖尖， 形成了一些缺綠的莖和根。2奠基階段自 Haberlandt 的實(shí)驗(yàn)之后，直到 1934年美國的 White 由番茄根建立了第一個(gè)活潑生長 的無性繁殖系， 并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)， 使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了真正的成 功，并在以后 28 年間培養(yǎng)了 1600 代。這之后， White 又以小麥根尖為材料，研究了光、溫 度、通氣、 pH 值、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對生長的影響，并于 1937 年建立了第一個(gè)組 織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成分均為化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來被定名為W

12、hite培養(yǎng)基。與此同時(shí)，Gautherer (1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了 B 族維生素和生長素對組織培養(yǎng)的重要意義， 并于 1939 年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White 由煙草種間雜種的瘤組織， Nobecourt 由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White 和 Nobecourt 一起被譽(yù)為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。 我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基， 根本上都是由這三位科學(xué)家建立的。后來， White 于 1943年發(fā)表了?植物組織培養(yǎng)手冊? 專著，使植物組織培養(yǎng)開始成為一門新興的學(xué)科。3快速開展

13、和應(yīng)用階段40 年代 Skoog 和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺 苷可以解除培養(yǎng)基中生長素( IAA )對芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺 嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時(shí)， 產(chǎn)生芽； 這一比例低時(shí)，那么形成根；相等那么不分化。 在尋找促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)過程中， Miller 等人于 1956 年發(fā)現(xiàn)了沖動素。 不久即知道沖動素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽， 并且效果可增加 3萬倍。 結(jié) 果上述控制器官分化的激素模式變?yōu)闆_動素與生長素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)， 有力地推動了植物組織培養(yǎng)的開展。1952年； Morel

14、和 Martin 通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中 首次獲得無病毒植株。19351945年Muir把單細(xì)胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培 養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂，即實(shí)施了看護(hù)接種技術(shù)，使單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶別離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株， 這不僅在理論上證明了無壁的原生質(zhì)體同樣具 有全能性，而且在實(shí)踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。80年代中期以來，對禾谷類作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國學(xué)者做出了重要奉獻(xiàn)。1962 年印度Guha 等人成功地在毛葉

15、曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，從而促進(jìn)了花藥 和花粉培養(yǎng)的研究。以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物培養(yǎng)中獲得 成功， 其數(shù)目到達(dá) 160多種， 其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養(yǎng)在中國取得了引入注 目的成就。1960年， Morel 提出了一個(gè)離體無性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。由于這一方法 有很大的應(yīng)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。1973年Carlson等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，Cocking 等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交， 研究得到了迅速開展， 已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細(xì)胞增

16、殖分化生 成雜種植株。在整個(gè)植物組織培養(yǎng)開展的歷史中， 我國學(xué)者做出多方面的奉獻(xiàn)， 除了前述的崔徵的研 究成效以外，還有 1993 年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的研究工作，以及羅士韋 關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚的研究培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚的研究培養(yǎng)工作。三、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用 植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個(gè)廣闊領(lǐng)域， 除了在根底理論的研究上占有重要地位以 外，還在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到越來越廣泛的應(yīng)用。(一) 植物組織培養(yǎng)的快速繁殖用植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖 (rapidpropagation) 是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括 花卉欣賞植物、蔬菜、果樹、大田作物及其他經(jīng)濟(jì)作物。

17、快繁技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制， 生長周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖?？焖俜敝晨捎靡韵率侄芜M(jìn)行：通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產(chǎn)生大量腋芽；通過根、葉等 器官直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽； 通過愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。 試管快速繁殖應(yīng)用在以下生 產(chǎn)或研究中： (1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。 (2)繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無病毒苗。 (3)繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養(yǎng)周 期短， 增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)， 加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化， 這就可使有限的空 間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。組織培養(yǎng)突出的優(yōu)點(diǎn)是“快，通過這 一方法在較

18、短時(shí)期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量， 以一個(gè)莖尖或一小塊葉片為基數(shù)， 經(jīng)組織培養(yǎng)一 年內(nèi)可增殖到 10 000100 000株。(二) 脫毒植物在生長過程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類甚至同時(shí)受到數(shù)種病毒病的危害， 尤其是很多園藝植物靠無性方法來增殖， 假設(shè)蒙受病毒病，代代相傳，越染越 重，甚至?xí)斐蓸O嚴(yán)重的后果。自從 Morell952 年發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無病毒苗 (virus free) 后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。假設(shè)再與熱處理相結(jié)合， 那么可提高脫毒培養(yǎng)的效果。 對于木本植物， 莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長， 那么可采用莖 尖微體嫁接的方法來

19、培育無病毒苗。組織培養(yǎng)無病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用， 如馬鈴薯， 甘薯，草莓， 蘋果， 香石竹， 菊花等。而且已有不少地區(qū)建立了無病毒苗的生產(chǎn)中心， 這對于無病毒苗的 培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)程序，從而到達(dá)了保持園藝 植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。三體細(xì)胞無性系變異和新品種培育 breeding 植物組織培養(yǎng)過程中往往存在大量的變異， 這種變異稱為體細(xì)胞無性系變異。 具有如下 特點(diǎn)：1變異的無方向性：既有有利的變異，也有有害的變異既有形態(tài)變異，也有生理變異。2變異的普遍性：變異在組織培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生，出現(xiàn)在組織培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期。既有數(shù) 量性狀變異

20、，又有質(zhì)量性狀變異。既有農(nóng)藝性狀變異，又有經(jīng)濟(jì)性狀變異；既有表型變異， 又有生理變異。 與自然變異與輻身誘變相比， 體細(xì)胞無性系變異廣泛而普遍。 且易于獲得純 合個(gè)體。3植物體細(xì)胞無性系變異的類型：一類為可遺傳變異，主要是由于遺傳物質(zhì)的變化引 起的尤以基因突變?yōu)橹?。另一類是不可遺傳的變異，為生理型變異。往往是由于培養(yǎng)過 程中外加的激素及其它化學(xué)物質(zhì)的刺激引起。如葉形、育性等。4弓|起植物體細(xì)胞無性系變異的原因：激素的刺激為主要原因。高濃度的GA和IAA ,會造成畸形胚的高頻發(fā)生， TDZ可使植株產(chǎn)生白化苗或玻璃化植株。 2，4-D那么使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā) 生染色體數(shù)量變化。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，染色體變異

21、頻率升高，變異的性狀和范圍手?jǐn)U大。5植物體細(xì)胞無性系變異的利用價(jià)值及途徑：它是一種重要的遺傳變異來源，是一種 重要的遺傳資源。對于育種有重要的應(yīng)用價(jià)值。四單倍體育種花藥、花粉的培養(yǎng)在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍(lán)、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。 在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)過多代自交， 而單倍體育 種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。五種質(zhì)保存 用植物組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1在較小的空間內(nèi)可以保存大量的種質(zhì)資源。2具有較高的繁殖系數(shù)。3防止外界不利氣候及其他栽培因素的影響，可常年進(jìn)行保存。4不愛昆蟲、病毒和其他病原體的影

22、響。 5有利于國際間的種質(zhì)交換與交流。六遺傳轉(zhuǎn)化 大多數(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法需要通過植物組織培養(yǎng)來進(jìn)行。本章小結(jié) ：1植物組織培養(yǎng)是指別離單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或植物體的一局部，在人工配制的培養(yǎng)基 上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長成一株完整植物體的過程。2按照外植體的不同，組織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng) 和原生質(zhì)體培養(yǎng) 5 種類型。 3組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利 于工廠化生產(chǎn)的突出特點(diǎn)，因而開展迅速。4組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要表達(dá)于以下幾個(gè)方面：快速繁殖優(yōu)良苗木； 獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。第2章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)(

23、4學(xué)時(shí))第節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備第二節(jié)1培養(yǎng)基及其配制第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第四節(jié)試管苗的馴化與移載本章小結(jié)目的要求：(1) 掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)；(2) 掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及其使用方法；(3) 掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。掌握滅菌和消毒的區(qū)別；(5) 掌握滅菌的不同方法和具體操作過程；(6) 掌握無菌接種的步驟；(7) 掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟；(8) 一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法；(9) 掌握試管苗馴化的根本程序；在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最根本的設(shè)備條件有個(gè)全面的 了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改

24、建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，那么會限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)，防止某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組 織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具， 同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第一節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備一、設(shè)計(jì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)包括：洗滌室、配置室、無菌室、培養(yǎng)室、觀察室等。 在實(shí)際中可結(jié)合可行條件，合并一局部。(一) 洗滌室(cleaning room)洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、枯燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)

25、配備大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運(yùn)輸培養(yǎng) 器皿。備有枯燥架，用于放置枯燥涮凈的培養(yǎng)器皿。(二) 準(zhǔn)備室(repairing room)準(zhǔn)備室要求明亮、 通風(fēng)。 在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、 清洗與整理工 作。如果房間較多， 可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩局部。 洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與 培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室那么負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。三緩沖室 進(jìn)入無菌室前要在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。 應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安 裝滅菌用的紫外燈?？刂茻o菌室及培養(yǎng)室的配電板等。四無菌操作室 tra

26、nsfering room 接種室是進(jìn)行植物材料的別離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。 其無菌條件的好壞 對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。在工作方便的前提下，接種室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動。接種室要求干爽安靜， 清潔明亮。 在適當(dāng)位置吊裝 1-2 盞紫外線滅菌燈， 用以照射滅菌。 最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。五 培養(yǎng)室 culturing room 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、 數(shù)目、 及其他附屬設(shè)備而定。 其設(shè)計(jì)

27、以充分利用空間和節(jié)省能源為原那么。 高度比培養(yǎng)架略高 為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè) 5 層，最低一層離地高約 l0cm ，其他每層間隔 30cm 左右，培養(yǎng)架即高 1. 7m 左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的 長度而設(shè)計(jì)，如采用 40W日光燈，那么長1.3m, 30W的長Im ,寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在2027 C左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。 由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度, 最好不同種類有不同的 培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定,相對濕度以保持在70 80為好,可安裝加濕器。

28、控制日光照時(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，一般需要每天光照1016h也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件,長日照 植物需要長日照條件?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采 用天然太陽光照作為主要能源,這樣不但可以節(jié)省能源,而且組培苗接受太陽光生長良好, 馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。六馴化室馴化室要求清潔無菌, 配有空調(diào)機(jī)、 加濕器、 恒溫恒濕控制儀、 噴霧器、 光照調(diào)節(jié)裝置、 通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。七溫室 應(yīng)配有空調(diào)機(jī)、通風(fēng)口、加濕器、恒溫恒濕控制裝置、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置以及必要的殺菌殺蟲裝置及相應(yīng)藥劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具一儀器設(shè)備見實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)1超凈臺,優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如,比較舒適,工作

29、效率高,準(zhǔn)備時(shí)間短。開機(jī)10分鐘即可操作, 可進(jìn)行長時(shí)間使用。 在工廠化生產(chǎn)中, 接種工作量很大, 需要經(jīng)常長久地工作時(shí), 超凈臺是很理想的設(shè)備。超凈臺功率在145260W左右，它裝有小型鼓風(fēng)機(jī)，使空氣穿過一個(gè)前置過濾器, 在這里把大局部空氣塵埃先過濾掉, 然后再使空氣穿過一個(gè)細(xì)致的高效過 濾器,它除去了大于 0. 3um 的塵埃、細(xì)菌和真菌孢子等,最后以較潔凈的氣流吹到工作臺 面。超凈空氣的流速為每分鐘 2430m,這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染， 這樣的 流速也不會阻礙采用酒精燈對器械等的灼燒消毒。 在這樣的無菌條件下操作， 就可以保證無 菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染。超凈臺分水平

30、式和垂直式二種型號。2無菌箱,在投資少的情況下,可以用接種箱來代替超凈臺。接種箱依靠密閉、藥劑 熏蒸和紫外燈照射來保證內(nèi)部空間無菌。但操作活動受限制,準(zhǔn)備時(shí)間長,工作效率低。3空調(diào)機(jī)，保證室內(nèi)溫度，一般為25 ± 2 C,應(yīng)安置在室內(nèi)較高的位置。以便于排熱散涼。4 .除濕機(jī)，培養(yǎng)室的濕度應(yīng)為7080%濕度過高易長雜菌，濕度過低培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)基會失水變干，影響培養(yǎng)物的生長。5恒溫箱，用于植物材料的培養(yǎng)，可以控制溫度、濕度及光照等。6烘箱，用于枯燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重。用于枯燥需保 持80100C；進(jìn)行干熱滅菌需保持 150 C,達(dá)13h;假設(shè)測定干物重，那么溫

31、度應(yīng)控制在 80 C 烘干至完全枯燥為止。7高壓滅菌鍋，用于進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式 高壓滅菌鍋。 如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn), 應(yīng)選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。 通常以電 作能源。&冰箱，主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。9 電子分析天平和托盤天平，電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、 激素等微量藥品精確度為 0.0001g；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其精確度為 0. 1g。天平應(yīng)放置在枯燥、不受震動的天平操作臺上。10顯微鏡及解剖鏡，種類較多，用于別離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。雙筒解剖鏡 在別離

32、莖尖等較小組織時(shí),便于觀察、操作,通常放大 5-80 倍。放大 40 倍以上操作需要有 相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。 為進(jìn)行操作, 要有照明裝置。 解剖鏡上帶有照相裝置, 根據(jù) 需要隨時(shí)對所需材料進(jìn)行攝影記錄。11. 水浴鍋，用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條12. 搖床與轉(zhuǎn)床、用于改善液體培養(yǎng)材料的通氣狀況及促進(jìn)酶解原生質(zhì)體的解離。一般在液體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)速為每分鐘 100次左右,在解離原生質(zhì)體時(shí)為每分鐘80左右。13磁力攪拌器，磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等。 磁力攪拌器還可加熱,使之更利于溶解。14電蒸餾水器，電蒸餾水器，采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)

33、基,配制培養(yǎng)基可用自來水來代替,假設(shè)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話,那么須用蒸餾水。15酸度計(jì)，組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準(zhǔn)確度是十分重要的，應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì)，假設(shè)無酸度計(jì),也可使用 pH 試紙進(jìn)行粗測。首次使用酸度計(jì)前,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位,然后固定。測量 pH 值時(shí),待測液必須充分 攪拌均勻。 如果培養(yǎng)基溫度過高, 測量時(shí)要調(diào)整 pH 值計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。 注意保護(hù)好玻璃電極,用后電極應(yīng)用蒸餾水沖洗凈,蓋上電極帽。16、離心機(jī)，用于收集原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)速要求較低。一般為10004000rpm即可。二各類器皿1. 培養(yǎng)器皿：在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶 解度小的硬質(zhì)

34、玻璃制成, 以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果； 培養(yǎng)用的還要求透光度好, 能 耐高壓高溫， 能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿， 根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求， 可以采用不同 種類、規(guī)格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是三角瓶，規(guī)格有l(wèi)00ml ，250ml ， 500ml 等，一般使用 l00ml 三角瓶，無論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長，受光也比試管好。由于瓶口較小， 亦不易污染。培養(yǎng)皿常用 9、 12cm 直徑等規(guī)格，要求上、下能密切吻合。這在游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、 花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的別離等都需采用。試管常用 18mm

35、Xl80mm 或 20mmX200mm 規(guī)格。可用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不 易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材， 采用一些代用品。 工廠化生產(chǎn)可采用廣口的 200ml 罐頭瓶， 加 蓋半透明的塑料蓋， 由于瓶口大，所以大量繁殖時(shí)操作方便、 工作效率高， 也減少了培養(yǎng)材 料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。目前， 培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。 塑料容器具有質(zhì) 輕、透明、不易破碎、本錢低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可提高培養(yǎng)空間利用率 的植株數(shù)， 并能一層層地疊摞起來， 從而節(jié)約空間。 這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成， 能耐高溫， 可進(jìn)行高壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性消耗

36、品， 不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí) 間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時(shí)比較方便。瓶口封塞可用多種方法， 要具有一定的通氣性和密閉性， 以防止培養(yǎng)基枯燥和雜菌污染。 以前封口常用棉塞。 但這種封口方法夏季極易污染， 且不易保持培養(yǎng)基的濕度。 現(xiàn)在多采用 聚丙烯塑料薄膜作為封口， 以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。 為了增加通氣性， 可在里面襯一層硫 酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便，且通氣好。也可采用專用的封口膜。2分注器，小型操作時(shí)可采用燒杯直接分裝。大型實(shí)驗(yàn)室可采用醫(yī)用“下口杯作為 分裝工具，在“下口杯的下口管上套一段軟膠管，加一彈簧止水夾，使用時(shí)非常適宜。更 大規(guī)?；蛞?/p>

37、求更高效率時(shí)，可考慮采用液體自動定量灌注設(shè)備。3離心管，用于離心收集原生質(zhì)體，一般用5ml、 10ml 規(guī)格。4. 刻度移液管，常用的有 0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml。用于配制培養(yǎng)基 時(shí)吸取不同種類的母液。應(yīng)多準(zhǔn)備幾支，分開使用。5細(xì)菌過濾器，用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細(xì)菌。一般采用0.22um微孔濾膜進(jìn)行抽濾滅菌。包括濾頭，注射器或采用抽濾裝置：真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。6.實(shí)驗(yàn)器皿，在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 燒杯；10ml、l00ml、10

38、00ml 量筒；100ml、 1000ml 試劑瓶 (棕色 )等等。(三) 器械用具1 .鑷子類( forceps )常應(yīng)用醫(yī)療上的鑷子。根據(jù)操作需要有各種類型，假設(shè)用 l00ml 的三角瓶作為培養(yǎng)瓶，可 用 20em 長的鑷子。 鑷子過短. 容易使手接觸瓶口， 造成污染。 鑷子太長， 使用起來不靈活。 如在別離莖尖幼葉時(shí)，那么用鐘表鑷子。2. 剪刀類( scissors) 可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由 于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3. 解剖刀切割較小材料和別離莖尖分生組織時(shí)， 可用解剖刀。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀 態(tài)，否那么切

39、割時(shí)會造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。4解剖針解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。 也可用于別離微莖尖的幼葉， 可以自 制。5接種工具包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成6鉆孔器 用于取肉質(zhì)莖、塊莖、肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時(shí)采用。一般為 T 字型。口徑有各種規(guī)格。 7其它包括酒精燈，電爐，試管架，搪瓷盤等多種。第二節(jié) 培養(yǎng)基及其配制 目的要求：(1) 一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)；(2) 掌握根本培養(yǎng)基的配方；(3) 一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；(4) 掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟；(5) 熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；(6) 一般掌握培養(yǎng)基的篩

40、選方法。培養(yǎng)基( culture medium )是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植 物的組織對營養(yǎng)有不同的要求， 甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同， 只 有滿足了它們各自的特殊要求， 它們才能很好地生長。 因此， 沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切 類型的植物組織或器官， 在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)， 首先必須找到一適宜的培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 才有可能成功。 在植物組織培養(yǎng)歷史進(jìn)程中， 事實(shí)上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。 對植 物的營養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識， 對已有培養(yǎng)基的改進(jìn)， 或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、 新的有益成分 應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速開展，取得

41、越來越多的成功。 一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大 類。1水水是植物原生質(zhì)體的組成成分， 也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 它是生命活動過程中 不可缺少的物質(zhì)。 配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水， 以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性， 防止 貯藏過程發(fā)霉變質(zhì) '大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的 變化引起不良效果。2無機(jī)元素 (inorganicelement)大量元素，指濃度大于 05mmolL 的元素，有 N，P，K，Ca，Mg，S 等。其作用是：(1) N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿

42、等的組成成分，是生命不 可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以 N03-N 和 NH4-N 兩種形式供給。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO， -N 又含 NH4-N 。 NH4-N 對植物生長較為有利。供給的物質(zhì)有KN03 、 NH4NO3 等。有時(shí)，也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。(2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成局部。磷也是ATP、ADP 等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能 量，而且也促進(jìn)對 N 的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有 KH2P04 或 NaH2P04 等。(3) K 對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。

43、K 增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成 增加，維管束、纖維組織興旺，對胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為 1-3mg L 為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以 KCl 、 KNO ，等鹽類提供。(4) Mg、S和Ca、Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以 MgS04 7H20提供。用量為13mg/ L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì) 胞壁的一種成分，Ca對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2 2H20提供。(5) 微量元素 指小于0.5mmol /L的元素，F(xiàn)e, B, Mn , Cu, Mo , Co等。鐵是一些氧 化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成

44、分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。 培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、 芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。 在制做培養(yǎng)基時(shí)不用 Fe2(S04)3 和FeCl3(因其在pH值5. 2以上，易形成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用FeS047H20和 Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B, Mn , Zn, Cu, Mo , Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可 缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長，發(fā)育異常現(xiàn)象?？傊参锉匦锠I養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以 及作為酶的活化劑，參與活潑的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平 衡等電化學(xué)方面起著重要作用。 當(dāng)某些營養(yǎng)元

45、素供給缺乏時(shí)， 愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥 狀。如缺氮，會表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫， 表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，那么影響細(xì)胞的伸長。3有機(jī)化合物 (organic compound)培養(yǎng)基中假設(shè)只含有大量元素與微量元素， 常稱為根本培養(yǎng)基。 為不同的培養(yǎng)目的往往要 參加一些有機(jī)物以利于快速生長。常參加的有機(jī)成分主要有以下幾類：(1) 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組 織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%,即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5

46、%，但在胚培養(yǎng)時(shí)采 用 4 15的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。 從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相當(dāng),麥芽糖差一些。 不同植物不同組織的糖類需要量也不同,實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取,不能任意取量。 高壓滅菌時(shí)一局部糖發(fā)生分解、 制定配方時(shí)要給予考慮。 在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí), 可用食用的綿白 糖代替。(2) 維生素 (vitamin) 這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝 活動, 對生長、 分化等有很好的促進(jìn)作用。 雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需 的維生素,但在數(shù)量上還明顯缺乏,通常需參加一至數(shù)種維生素

47、,以便獲得最良好的生長。 主要有Vsl(鹽酸硫胺素卜VD6(鹽酸吡哆醇卜Vpp(煙酸卜VC(抗壞血酸)、有時(shí)還使用生物 素、葉酸、VB2等。一般用量為0. 11.0mg/L。有時(shí)用量較高。Vm對愈傷組織的產(chǎn)生和 生活力有重要作用, VB6 能促進(jìn)根的生長, Vpp 與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。 Vc 有 防止組織變褐的作用。(3) 肌醇 (myo-inosit0l) 又叫環(huán)己六醇， 在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 通?？捎闪姿?葡萄糖轉(zhuǎn)化而成， 還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)， 用于構(gòu)建細(xì)胞壁。 肌醇與 6 分子磷酸殘基相結(jié) 合形成植酸，植酸與鈣、 鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，

48、參與細(xì)胞膜 的構(gòu)建。使用濃度一般為lOOmg / L,適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。(4) 氨基酸 (aminoacide) 是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用 的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白， 它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物， 是含有約 20種氨基酸的混合物，用量在 101000mg/L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。 如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。(5) 天然復(fù)合物 其成分比較復(fù)雜，大多

49、含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對 細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用， 但對器官的分化作用不明顯。 它的成分大多不 清楚，所以一般應(yīng)盡量防止使用。1) 椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在 1020，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn) 作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小假設(shè)超過1mm時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。2) 香蕉 用量為150200ml/l。用黃熟的小香蕉，參加培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進(jìn)作用。3) 馬鈴薯(pota

50、to)去掉皮和芽后，加水煮 30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為 150200g/ L。對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4) 水解酪蛋白 為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為 100200mgL。 受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。5) 其他 酵母提取液 (YE)(0 . 01 0. 05) ，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0.01%-0.5% )、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。4植物激素 (hormone)是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物， 它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、 分裂、

51、 發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多 的生理生化活動， 在培養(yǎng)基的各成分中， 植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)， 對植物組織培養(yǎng)起 著決定性作用。(1) 生長素類 (auxin) 在組織培養(yǎng)中， 生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成， 誘導(dǎo)根的分 化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、 伸長生長。在促進(jìn)生長方面， 根對生長素最敏感。 在極低的濃度下， (10-5 10-8mg / L)就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件 易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。IAA (indoaceticacid ，吲

52、哚乙酸 ) 是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是 生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的 IAA 分解酶降解，受光也易分解。IBA (indolebutyric acid ，吲哚丁酸 )是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。NAA naphthaleneaceticacid，萘乙酸在組織培養(yǎng)中的起動能力要比 IAA高出34倍， 且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA 和 IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。2， 4-D 2， 4-二氯苯氧乙酸 起動能力比 IAA 高 10 倍，特別在促進(jìn)愈

53、傷組織的形成上 活力最高， 但它強(qiáng)烈抑制芽的形成， 影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒 效應(yīng)。生長素配制時(shí)可先用少量 95 %酒精助溶。2, 4-D可用0. 1mol / L的NaOH或KOH助 溶。生長素常配成 1mgdml 的溶液貯于冰箱中備用。2GA gibberellicacid ，赤霉素 有 20 多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株； 赤霉素和生長素協(xié)同作用， 對形成層的分化有影響， 當(dāng)生長素赤霉素比值高時(shí)有利 于木質(zhì)局部化，比值低時(shí)有利于韌皮局部化；此外，赤霉素還用于打破休眠，

54、促進(jìn)種子、塊 莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)可用少量 95%酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有 70% 100%失效，應(yīng)當(dāng)采用過濾滅菌法參加。3細(xì)胞分裂素類 cytokinin 這類激素是腺嘌呤的衍生物， 包括 6-BA6- 芐基氨基嘌呤 、 Ktkinetin 沖動素 、 Zt zeatin 玉米素 等。其中 Zt 活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是 6-BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用： 誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長， 細(xì)胞分裂 素與生長素相互作用， 當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長素的比值高時(shí)， 誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化 出不

55、定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽 的分化、莖、苗的增殖，而防止在生根培養(yǎng)時(shí)使用。生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向， 是愈傷組織、是長根還是長芽。 如為了 促進(jìn)芽器官的分化， 應(yīng)除去或降低生長素的濃度， 或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的 比例。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mgL 表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0. 055mg/L,細(xì)胞分裂素 0.0510mg/L。5培養(yǎng)材料的支持物1瓊脂 agar 在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。 瓊脂是一種由海藻中提取的高

56、分子 碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40C即凝固為固體狀凝膠。通常所說的 煮化"培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90C以上的熱水。瓊脂的用量在610g/ L之間，假設(shè)濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的 組織中去。 假設(shè)濃度過低， 凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以 顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還 與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、 pH 值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會使凝固能力下降，過酸過 堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解， 喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊脂變褐， 也會逐漸喪失凝

57、固能 力。參加瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，通氣問題易于解決， 便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸即吸收 面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢， 影響?zhàn)B分的充分利用， 同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物， 聚集在吸收表 面，對組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是 Ca、 Mg 及其他微量元 素。因此在研究植物組織或細(xì)胞的營養(yǎng)問題時(shí)， 那么應(yīng)防止使用瓊脂。 可在液體培養(yǎng)基外表安 放一個(gè)無菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。(2) 其他 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有 影響或影響較小。6抗生物質(zhì) (antibiotic)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等