1、生物化學與分子生物學實驗1. 分光光度計（1） 基本原理：溶液溶質在其一定波長的吸收光中，其吸光度值與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，即遵循朗伯比爾定律，通過也在一定液體厚度時測定其吸光度來與標準曲線比較從而測得待測液溶質濃度。 （2） 吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數學表達式為： A-lgTbc A：吸光度，又稱光密度“O.D”；：吸光系數（L·mol1·cm1）；比例常數，稱吸光系數b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，則b=1cm； c：樣品濃度（mol/L）。吸光度“A”具有加和性,即混合物的

2、總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎。 若溶液中各溶質的吸光系數相同，則各溶質吸光度的大小與溶質濃度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純溶劑的吸光度為0.070，已知其摩爾吸光系數 = 8.2×103 M-1cm，計算其摩爾濃度. AbC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1×10-5 mol / L（2）等電點的計算方法；標準曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標準溶液。（2）在測定條件相

3、同的情況下，分別測定其吸光度。（3）以標準溶液濃度為橫坐標（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應的吸光度為縱坐標，繪制A-C關系圖。（4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出濃度。2、 酪蛋白的提取過程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白質是酪蛋白，它是一些含磷蛋白質的混合物，等電點為4.8。利用蛋白質在等電點時溶解度最低的性質，將牛乳的PH調至4.8時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質后便可得到純化的酪蛋白。(2).主要試劑：牛乳醋酸鈉緩沖液0.2M,PH.6，乙醇，乙醚，氫氧化鈉PPT后面問題：（1）醋酸緩沖液、蒸餾水、乙醇、丙酮洗滌沉淀的目的分別是什么？醋酸

4、緩沖液：調節PH到等電點4.8。蒸餾水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂類物質。丙酮洗滌：脫水。（2）最后所得的沉淀中加入0.1mol/L NaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白質，溶解于堿性溶液中，方便下次雙縮脲法測定。（3）制備高產率 酪蛋白的關鍵是什么？剛開始時對牛奶的ph的調節,最好是調節到4.7,越接近越好,這是最主要的。（4）請設計另一種提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高濃度(NH4)2SO4溶液2、10000轉/分,5分鐘，去上清液3、95%乙醇4ml洗滌離心，10000轉/分，5分鐘，去上清液4、丙酮4ml洗滌離心，10000轉/分，5分鐘，去上清液5

5、、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、雙縮脲法測蛋白質含量(1).蛋白質測定的5種方法: 凱式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 雙縮脲法（Biuret法） Folin-酚試劑法（Lorry法） 考馬斯亮藍法（Bradford法） TCA：三氯乙酸4.考馬斯亮藍法測定蛋白質含量原理：考馬斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，染料主要是與蛋白質中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結合，使染料最大吸收峰位置,由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。在595nm下測定的吸光度A595，與蛋白質濃度成正比。(1).干擾物質有哪些？TritonX-100、SDS、強堿

6、性緩沖液等(2).G250與R250的區別：比考馬斯亮藍R250多二個甲基，染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。優點在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體,能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復性好和穩定的染色，適于作定量分析。(3).PPT后的4個思考題。說明各種蛋白質含量測定法中哪幾種可以測出蛋白質的絕對含量，哪幾種只能測定其相對含量，為什么？ 只有凱氏定氮法可以測定蛋白質的絕對含量，因為每6.25蛋白質含1g氮，試驗中可以除去非蛋白氮，所以，通過氮含量的測定，可以得到蛋白質的絕對含量。其他的幾種方法，由于都使用了標準蛋白制作標準曲線，所以，所測得的未知蛋白的含量，都是

7、相對于標準蛋白含量而言的。考馬斯亮藍法測定蛋白質含量使用的局限性有哪些？(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白質時有較大的偏差，最好選用與待測樣品氨基酸成份相同的標準蛋白。(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的TritonX-100、SDS、強堿性緩沖液等。(3)標準曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進行計算而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。在實驗中，使用的水一定是蒸餾水嗎？為什么？ 因為Bradford檢測中要用的試劑配制,標準曲線的制作都要用到水.如果不是使用蒸餾水,可能水里面會有一些游離的離子或者電解質,會影響試劑配制

8、的準確性,干擾實驗結果.而水中殘留的有機物等可能會和考馬斯亮藍發生變色反應,這樣制作的標準曲線會比實際值偏高,導致最終濃度檢測的結果比實際結果偏低。SDS干擾考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的原理是什么？當溶液中存在一定量的SDS后所測得的吸光度比正常值相對減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量應沒有呈現出很明顯的規律。由于SDS 的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結合，使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對蛋白質的競爭結合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線前段呈下降趨勢；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質的空間結構更加伸展，一些原來包裹在結構中的堿性氨基酸和芳香族

9、氨基酸暴露出來，所以會有少量的吸光度回升；但最終SDS與蛋白質的結合達到所處溶液條件下的“飽和”時，過量的SDS就不起作用了，曲線是最后為平緩段。  要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結合生成沉淀的性質將其去除。K+對考馬斯亮藍方法不產生干擾。5、醋酸纖維薄膜電泳原理：生物分子在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向不同分子以不同速度移動。電泳影響因素： 蛋白質在電場中移動的速度取決于蛋白質所帶的電荷性質、數量、自身大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場強度、溶液的PH、離子強度等。(1).結合實驗報告冊，回憶操作過

10、程，首先醋酸纖維薄膜先看粗糙面，在粗糙面上畫點樣線，畫好后做標記，泡在緩沖溶液中浸泡完全（上面無白斑），然后點樣，點樣后放掉電泳槽中電泳，電泳后染色，然后脫色。（熟悉整個過程，如果把過程打亂，能否正確排序？）（選擇題）結果是5條帶，哪條帶最接近點樣線，哪條線最遠。要求會畫圖，畫圖要記得畫點樣線。(2).血清蛋白的臨床意義。組成：白蛋白、1、2、和-球蛋白;功能：維持血漿膠體滲透壓；調節血漿pH值，維持酸堿平衡；運輸營養物質、代謝物、激素、藥物及金屬離子等；免疫作用。血清蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為6080g/L減少：長期慢性發熱 、 大面積燒傷（白細胞增多）， 惡性腫瘤 、 肝癌（淋巴

11、細胞和核細胞增多） ， 肝功能嚴重受損 、 肝壞死 、 肝硬化（谷丙轉氨酶增多） ， 甲狀腺功能亢進 、 漿膜滲出性損害 、 結核病 、 慢性腹瀉 、 慢性肝炎 、 腎病綜合征 、 吸收不良綜合征 ， 營養不良、貧血（紅細胞，紅蛋白稍偏低）等。增加：大量出汗 、 多發性骨髓瘤 、 腹瀉 、 巨球蛋白血癥 、 嚴重嘔吐、中毒等。6、血糖測定（吳憲血糖測定法）(1).吳憲血糖測定法的優勢（波長620nm）:優點：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多工作原理：葡萄糖 Cu(OH)2 Cu2OCu2O 磷鉬酸 鉬藍鉬藍的藍色深淺與葡萄糖的含量成正比，所以可以用比色法來測定鉬藍的光吸收值來測定血糖的含量（波長6

12、20nm)。（2）為什么選用無蛋白血濾液？有蛋白的話會與堿性銅試劑發生雙縮脲反應，也呈藍色，干擾最后的結果（3）水浴8min后，取出為何切記搖動？ 氧化亞銅易已被氧化（4）空腹血糖的正常范圍：一般空腹全血血糖為3.96.1mmol/L(70110毫克/分升)，血漿血糖為3.96.9mmol/L(70125毫克/分升)。空腹全血血糖6.7mmol/L(120毫克/分升)、血漿血糖7.8mmol/L(140毫克/分升)，2次重復測定可診斷為糖尿當空腹全血血糖在5.6mmol/L(100毫克/分升)以上，血漿血糖在6.4mmol/L(115毫克/分升)以上，應做糖耐量試驗。當空腹全血血糖超過11.1

13、mmol/L(200毫克/分升)時，表示胰島素分泌極少或缺乏。因此，空腹血糖顯著增高時，不必進行其它檢查，即可診斷為糖尿病。（5）PPT后的3個思考題Folin-吳憲法為什么要用無蛋白血濾液？有蛋白的話會與堿性銅試劑發生雙縮脲反應，也呈藍色，干擾最后的結果Folin-吳法測定血糖的優缺點是什么優點：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多，缺點是費時，要精確控操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性比較差，干擾物質比較多進行比色法測定時，如果測得樣品的A值超過100%，該如何處理，為什么？測得樣品值超過100%是因為有其它還原物質，使其待測液中血糖的濃度過高所造成的，應該將待測液稀釋后再進行比色

14、。7、谷丙氨酸酶的臨床意義；（1）、谷丙氨酸酶的測定方法；知道什么是賴氏法，什么是改良賴氏法？ （2）、改良后的方法優勢在哪？1.反應溫度：40改為37；2.底物濃度：高改低；3.套用卡門氏單位，與速率法一致，反映了酶的真實活性（3）、在做實驗時用到酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他們的原理以及試劑的作用； （4）、該實驗的注意事項：2，4-二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血標本不宜采用，因血細胞內轉氨酶活力較高，影響測定結果；在測定時，如酶活力較大（ 大于150KarU ），應將樣品稀釋后再進行測定。（5）、PPT后的6個思考題1、 ALT的臨床意義? AST的測

15、定對于肝病的診斷具有十分重要的意義，特別是AST/ALT比值大小對于臨床判定肝病嚴重程度具有十分重要的意義，是臨床診治肝病的重要指標之一2、血清谷丙轉氨酶測定的注意事項？以及為何要 避免溶血？常溫下標本不宜久存，（2）嚴重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標本可增加測定的吸光度，測定這類標本應做血清標本對照組（3）當標本的酶活性超過150K時，應將血清中用0.145mol/L氯化鈉稀釋重做，其結果乘以稀釋倍數（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接顯色物，NAOH的濃度與顯色深淺有關，因此它們的濃度必須很準確（5）丙酮酸標準濃度要求十分精確（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后應充分混

16、勻當溶血之后，紅細胞中的ALT會進入血液中，導致測得的實驗數據較大，不符合實際情況3、對照管的意義是什么? 減少非試驗因素對實驗結果的影響4、底物液為何要37預溫5min? 人體的體溫為37，只有在此溫度下酶的活性才會達到最大，因此必須先讓酶的活性達到最大才與底物反應5、為什么在制作標準曲線時要加入基質液？使反應的溶液體積相同，減少因體積不同而造成的實驗非決定性因素的影響 6、為什么在制作標準曲線時加入基質液的體積不同，對反應沒有影響？基底液與底物和酶都不反應，它的作用只是調節溶液的體積酶活性的單位：國際單位：1961年酶學委員會建議使用統一單位，在規定條件下，1分鐘內轉化1 mol底物所需的

17、酶量，稱為一個國際單位（IU，又稱U）。8、豬肝基因組的提取實驗原理一定要掌握。提取過程中用到的試劑作用；PPT后的思考題（1） 實驗原理：DNA與RNA的分離： DNP在0.14M NaCl鹽溶液中溶解度很低，而RNP則溶于0.14MNaCl鹽溶液，利用這一性質可將生物組織中的DNA與RNA分開。DNA在高濃度的鹽溶液中溶解度最大。去除DNP中的蛋白：SDS使之變性除去（同時破壞核酸分解酶）。進一步純化則利用氯仿-異戊醇震蕩除蛋白，震蕩時，蛋白質變性，形成凝膠，并與DNA分開，DNA則留在水層中。沉淀DNA：利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇將DNA 從溶液中沉淀出來。提取過程中用到的試劑作用

18、1、取新鮮豬肝4g，用0.14mol/L NaCl-0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10mL 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，置勻漿器中研磨。（初步破碎細胞）。（已做）2、取一支10 mL EP管，裝入糊狀物（基本裝滿），離心5 min（10000rpm），棄去上清液。沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗兩次。每次加入溶液后用吸管吹打均勻再離心（同上），直到上清液無血細胞。棄上清液，所得沉淀為DNP（DNA蛋白復合物）粗制品3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl -0.15mol/L EDTA溶液5m

19、L，然后每管滴加25%的SDS溶液1mL，邊加邊振蕩。加畢，置60水浴10min （不停振蕩），直至溶液變得粘稠并略透明，取出冷卻至室溫。此步驟使核酸與蛋白質分離。 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液2mL，蝴蝶形振蕩5min。加入約1倍體積的氯仿異戊醇混合液，蝴蝶形振蕩5min，離心10min（4000rpm）。 （此步驟后溶液分三個相：上層水相（DNA）；中層變性蛋白質相；下層有機相和殘余的RNA。） 5、吸出上清液，棄去沉淀。向上清液中緩慢加入1.52倍體積的95%乙醇，DNA沉淀析出，離心（4000rpm）5min用玻棒攪出的絲狀物則為粗DNA6、制備DNA溶液： 用0.1mol

20、/L的NaOH 1mL,溶解DNA沉淀，為下次的DNA含量測定提供材料PPT后的思考題1. 核酸提取中SDS、氯仿-異戊醇各有什么作用？SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。氯仿可去除DNA溶液中微量酚的污染，異戊醇還可減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡2. 結合本

21、人操作的體會，試述在提取過程中應應該注意些什么？且如何避免大分子DNA的降解和斷裂？震蕩過程中力度不能過大，力度過大會導致DNA分子斷裂，也會影響實驗的結果。離心時間應適合，時間太長可能會導致DNA分子斷裂，時間太短，會導致DNA分子不能得以與蛋白質分離，水浴時間與溫度應該適宜，溫度為65度時間為6分鐘最適合。3. 核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種？4種：紫外線吸收法，定磷法，二苯胺法，地衣酚（苔黑酚）法4. 預習：核酸定量測定方法有幾種？9、DNA樣品含量的測定（有5種方法；我們做了紫外法和二苯胺法，其他方法要掌握實驗原理，做實驗的兩種方法不僅要掌握實驗原理，還要掌握操作過程。）

22、二苯胺法實驗原理 脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環境中與二苯胺試劑一起加熱產生藍色反應，在595nm處有最大光吸收。 DNA在40-400ug范圍內，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應。其他多數糖類，包括核糖在內，一般無此反應。紫外吸收法實驗原理 DNA和RNA都有吸收紫外光的性質，它們的吸收高峰在260nm波長處。吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性10、質粒DNA提取（掌握實驗原理，試劑的作用；什么叫做質粒

23、？質粒的結構？質粒有什么特點？我們用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；以及最后的實驗步驟和注意事項；PPT后的3個思考題。）二苯胺法實驗原理 脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環境中與二苯胺試劑一起加熱產生藍色反應，在595nm處有最大光吸收。 DNA在40-400ug范圍內，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應。其他多數糖類，包括核糖在內，一般無此反應。質粒是一類存在于細菌和真菌細胞中具有自主復制能力的、共價閉合環狀超螺旋結構的小型DNA分子。堿裂解法提取質粒是實驗室常用的方法這種方法是根

24、據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們質粒的結構特點：1、染色體外的小型DNA分子；2、共價閉合環狀超螺旋結構;3、自主復制。作用 ： 1、 外源DNA的載體 2、保存基因 3、表達蛋白用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護、緩沖) 50 mmol/L葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（懸浮細胞） 25 mmol/L EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質粒分子的降解作用（保護作用） 10 mmol/L Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）溶液

25、II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性) 0.2 mol/L SDS：？ 1% NaOH（PH>12）：破壞細胞膜，裂解細胞 注意：堿裂解的時間不要太長，以免基因組DNA斷裂成小片 段。溶液III： 3mol/L HAc（pH4.8） 和 3mol/L KAc 組成的高鹽溶液 (復性，分離) HAc溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發生纏繞，并使質粒DNA復性。 KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽POD(十二烷基磺酸鉀)，并與蛋白質形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質-SDS復合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。PPT后的3個思考題。質粒提取

26、除了堿裂解法，還有其他什么方法？各種方法的優缺點？核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種？如果質粒DNA中有蛋白質殘留，如何判斷？在提取過程中應如何避免大分子DNA的降解和斷裂？11、PCR技術（知道操作中加了哪些試劑？試劑的作用是什么？PCR的原理主要是3個步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的？PCR的特性。）（1）、過程：首先95預變性設置1min，1min后94 30s進入變性過程；然后是退火52 30min；然后引物的延伸，72 30s，從這開始循環，72 10min，最后0保溫。（2）、試劑的作用是什么？（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶的用量為12.5U/100ul,

27、酶的濃度偏高，非特異性的產物將會增加，若酶的濃度偏低，側合成產物偏少。 Taq DNA聚合酶可分為兩大類： 1、具有校正功能的（有3'5'核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （無3' 5'核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶（二）模板核酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNa

28、se降解RNA。（三）引物 引物是待擴增核酸片段兩端的已知序列，它決定了PCR擴增產物的大小，引物的選擇是整個PCR反應的關鍵，引物的優劣直接關系到PCR的特異性及成功與否。 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。 （2）、PCR的原理主要是3個步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的？過程：首先95預變性設置1min，1min后94 30s進入變性過程；然后是退火52 30min；然后引物的延伸，72 30s，從這開始循環，72 10min，最后0保溫1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴

29、增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；2、模板DNA與引物的退火：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3、引物的延伸：DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。（3）、PCR的特性 1、特異性強：PCR反應的特異性決定因素為引物與模板DNA特異正確的結合、堿基配對原則、Taq DNA聚合酶合成反應的正確度、靶基因的特異性與保守性。 2、靈敏度高：PCR產物的生成量是以指數方式增加的。 3、簡便快速：PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA儀中進