1、小4號仿宋體、居中，作者在上、指導教師在 下；作者與標題、指導教師與摘要之間空小四單倍行距。摘要內容與正文左右縮進2字符，小4號仿宋體，兩端對齊方式排列，首行縮進2字符，行距20磅。不能用第一、第三人稱，不得出現評價性語言。標題小2號黑體、居中。應簡練，一般不超過25個漢字。木聚糖降解菌的篩選及分子鑒定“摘要”、“關鍵詞”字體為小四黑體。作 者：×××指導老師：×××摘要：從寶天曼地區采集的腐木中富集、分離出了16株能夠降解木聚糖的菌株。利用剛果紅活性染色法對菌株進行染色，根據透明圈的大小篩選出6株產木聚糖酶菌株。6株菌株在搖床180

2、 r/min、28 的條件下發酵培養48 h，利用DNS法測定各菌株木聚糖酶的活力大小，結果表明菌株M3的酶活力最高，酶活力為19.098 U/mL。提取菌株M3的基因組進行26S rDNA PCR擴增并進行序列測定，經相似性分析和系統發育樹分析，初步鑒定菌株M3屬于Trichosporon porosum。關鍵詞：木聚糖降解菌；篩選；分子鑒定；木聚糖酶；酶活正文與關鍵詞之間空小4單倍行距一行。正文文字用四號宋體、22磅行距、全角標點詞與詞之間用分號。一般為35個，盡量不與標題重復。0 引言種名用斜體上標格式按出現的先后順序標序；連續文獻如2-6，不連續文獻如1,4,7來表示。纖維素類物質是一

3、類大量存在而又可再生的重要潛在資源，半纖維素占總纖維素的15%30%，其中主要成分是木聚糖。與纖維素相比，半纖維素更易為微生物所降解和轉化1。木聚糖酶是一類以內切方式降解木聚糖分子中-1,4-木糖苷鍵的酶類，其水解產物主要是木二糖和木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。該酶具有廣泛的應用前景2，該酶在造紙業中部分替代二氧氯用于紙漿漂白，可改善紙漿性能；木聚糖酶作為飼料添加劑，可提高飼料的能量值和禽、畜對飼料的利用率；食品工業中可利用木聚糖酶降解半纖維素的主要成分木聚糖生產低聚木糖等高附加值的產品。可見木聚糖酶在工業中的用途非常廣泛。因此國內外很多研究者都致力于對木聚糖酶的研究，已有不少研究者對黑曲霉

4、、木霉(Trichoderma sp.)等真菌及短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)等細菌的木聚糖酶進行了研究。英文縮寫首次出現，應標出英文全稱。森林腐木中富含半纖維素，這種環境中有大量的微生物都能分解木聚糖，從中很容易篩選得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要從寶天曼森林腐木中富集、分離、篩選出產木聚糖酶菌株，并分析它們木聚糖酶的酶活力大小，找出酶活力較高的分離菌株。最后通過分子生物學方法測定分離菌株的26S rDNA序列并對其進行序列相似性分析和系統發育樹分析，初步鑒定出分離菌株在系統發育上的分類地位。一級標題用阿拉伯數字、小3號黑體、左頂

5、格，不加標點，段前、段后各空四號單倍行距一行。一級標題不可置于頁尾。序號與標題文字之間空一字之距。二級標題采用阿拉伯數字1.1、1.2等格式標引、4號黑體、左頂格、不加標點。序號與標題文字之間空一字之距。1 材料與方法1.1 樣品數值與單位之間空半字之距。取自實驗室保存的寶天曼地區采集的腐木。1.2 試劑2.2%溴鉀酚綠、1%剛果紅溶液、1 mol/L NaCl溶液、檸檬酸緩沖液、木糖溶液、DNS試劑、試劑酵母基因組提取試劑盒、PCR Magic Mix2.0、引物NL1、引物NL4、TAE緩沖液、瓊脂糖凝膠、EB試劑。1.3 培養基3富集培養基：木聚糖1%、酵母氮基礎培養基1%、氯霉素(80

6、 L/100 mL)；英文、數字、符合等用Time New Rome字體。分離培養基：酵母提取物0.5%、葡萄糖1%、溴鉀酚綠2%、瓊脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；鑒別培養基：木聚糖1%、酵母氮基礎培養基1%、瓊脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；三級標題采用阿拉伯數字等格式標引，4號宋體、左頂格、不加標點，序號與標題文字之間空一字之距。斜面培養基：酵母粉0.3%、麥芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、瓊脂2%、氯霉素（80 L/100 mL）；1.4 菌株篩選4,5 富集培養取7支干凈小試管，向每支試管中分裝入35 mL富集培養基，于121 高壓滅菌鍋中滅菌20 min。用鑷子夾

7、取少許實驗室保存的7種森林腐木分別放入已滅菌的富集培養基中，于28 溫箱中富集培養23 d。 平板分離對培養后變混濁的富集培養液按照梯度稀釋法用無菌水稀釋到10-5，在超凈工作臺中的無菌條件下，準確吸取100 L的10-310-5不同稀釋倍數的菌液涂布于已滅菌的平板培養基上，于28 溫箱中倒置培養23 d。 純化菌種根據菌落形態特征的比對，找出不同形態的菌株。在無菌條件下，挑取不同形態的單菌落在已滅菌的純化培養基上進行扇形劃線，于28 溫箱中倒置培養23 d。按照同樣的方法劃線23次后即可得到純菌落。用鑷子夾取已滅菌的牙簽，將純化培養基中的純菌落點蘸到鑒別培養基上，于28 溫箱中倒置培養23

8、d。待菌落長大后用1%剛果紅進行活性染色30 min，傾去染液，再用1 mol/L NaCl溶液漂洗1 h，觀察菌落周圍是否有透明圈出現以及透明圈的大小。出現透明圈的菌落即為所需要的木聚糖降解菌，再選出透明圈大且明顯的菌株接種到斜面培養基上于4 冰箱中保存備用。表包括表序、表題、表格、表注等。表與上下文之間空小四、單倍行距，標題在表上、小四宋體，表序與標題間空一字之距；表格為“三線表”格式（自動套用格式-簡明型1），首、尾線為粗線，表內文字為5號宋體。1.5 木聚糖酶活力的測定 木糖標準曲線的制備取烘干好的木糖0.1000 g溶解于蒸餾水中后，再用100 mL容量瓶定容至100 mL，得到1

9、mg/mL的木糖溶液。用木糖制備標準曲線的體系見表1。表1 制備木糖標準曲線的溶液體系（單位：mL）編號0123456木糖標準液蒸餾水DNS02.01.50.21.81.50.41.61.50.61.41.50.81.21.51.01.01.51.20.81.5注：表中所用試劑為純試劑表注在表格下方，5號仿宋字，與正文左右縮進2字符。取7支帶刻度的平底試管，編號為17，分別加入上述溶液。于沸水浴中煮沸5 min后，立即放入冷水中冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計在540 nm波長下測OD值并制作工作曲線備用。1.5.2 搖瓶培養取一環旺盛生長于斜面培養基上

10、的菌種接種到已滅菌的種子培養基中，28 、180 r/min進行三角瓶搖床培養24 h，取2 mL菌液加入已滅菌的發酵培養基中28 ，180 r/min搖床培養48 h。 木聚糖酶粗酶液的制備取5 mL發酵培養基菌液于已滅菌的10 mL離心管中，在4 離心機中6000 rpm離心20 min，轉移上清至另一離心管，則為所需的粗酶液。取各酶液1 mL裝入1.5 mL離心管中沸水浴煮沸10 min得到失活酶液作為空白對照。 木聚糖酶酶活力的測定6取25 mL具蓋帶刻度的平底試管，加入1.5 mL 1%木聚糖檸檬酸緩沖液于50 水浴預熱15 min，再加入0.5 mL相應酶液(對照中加入0.5 mL

11、滅活酶液)，50 水浴保溫30 min(隔幾分鐘震蕩數次)。然后加入1.5 mL的DNS試劑，沸水浴煮沸5 min，立即放入冷水中冷卻，并定容至25 mL。版面尺寸：A4（210毫米×297毫米）。正文位置：上、下邊界25毫米、左邊界30毫米、右邊界20毫米、裝訂線位置定義為0毫米。1.6 菌株的分子鑒定 基因組DNA的提取菌株基因組DNA的提取采用酵母菌基因組提取試劑盒法。用接種環從斜面培養基上取三環生長旺盛的酵母菌細胞，懸浮于500 L無菌水中，12000 rpm離心1 min，棄上清，沉淀即為各菌株的菌體。按照酵母菌基因組提取試劑盒中使用說明書上的流程進行各菌株基因組的提取，并

12、將其保存于TE緩沖液中，放入4 冰箱中保存備用。將各菌株基因組進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據條帶的亮度確定基因組的稀釋倍數，作為PCR擴增的模板。2 結果與分析2.1 菌株篩選用木聚糖作為唯一碳源從實驗室保存的腐木中分離能產木聚糖酶的菌種。2.2 基因組DNA的提取和PCR的擴增以NL1和NL4作為引物對菌株M3的26S rDNA基因組做特異性PCR反應擴增。將擴增的基因組進行瓊脂糖凝膠電泳分析得到單一條帶，片段大小長度約為600 bp，擴增產物無明顯非特異擴增現象，結果見圖1。圖包括圖形、圖序、圖題、圖注。圖題在圖下、小4號宋字、加粗，圖序與圖題間空一字之距；圖注在圖題下方、5號仿宋字，與正文

13、左右縮進2字符；圖形中應對與文中相關的信息標注。750bp500bp12圖1 菌株M3 26S rDNA電泳圖采用小4號宋體，用“第×頁（共×頁）”的格式，居中，距下邊界15毫米的位置。注：1、DL2000marker；2、菌株M32.3 26S rDNA 序列相似性分析測定菌株M3的26S rDNA序列，長度為595 bp，將獲得的26S rDNA堿基序列經DANMAN軟件處理后在GenBank核酸序列數據庫中通過BLAST進行同源序列搜索及相關信息檢索，得到菌株M3的26S rDNA序列與其他菌種的相似性，結果見表2。檢索結果表明，菌株M3與Trichosporon的2

14、6S rDNA序列有較高的相似性。3 討論木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，是自然界繼纖維素之后含量第二豐富的可更新的多糖。以往的研究中，半纖維素的再利用通常經過酸水解處理，而后再經微生物轉化為生產產品。然而，盡管酸水解速度快，但伴隨有毒性化合物產生，對隨后的生物轉化過程有影響。因自然界中許多微生物類群都能產生木聚糖酶，且微生物木聚糖酶水解法處理半纖維素更為安全和有效，因而大力開發經濟、高效的微生物木聚糖酶具有重要意義。以往研究的木聚糖降解菌主要集中在霉菌、放線菌等，而霉菌、放線菌等生產木聚糖酶周期相對較長，通常為47 d。少數產木聚糖酶細菌的產酶效率相對較低。本研究以木聚糖作為唯一碳源從森林

15、腐木中分離、篩選出6株木聚糖降解菌。利用剛果紅活性染色法對各菌株染色，根據透明圈的大小初步判定M3降解木聚糖的能力較強。進一步對各菌株進行酶活力測定，結果表明菌株M3在搖床180 r/min，28 ，48 h條件下利用1%木糖的酶活力最高，酶活力為19.098 U/mL。M3產酶效率高，發酵周期短，僅48 h。通過26S rDNA序列相似性分析得出，菌株M3與Trichosporon porosum親緣關系較近，其中與Trichosporon porosum的相似性為100%，因此初步鑒定菌株M3屬于Trichosporon porosum。用分子生物學的方法對酵母菌進行分子鑒定，是一種快速、

16、簡便和有效的方法。利用26S rDNA序列分析方法對酵母菌進行分離和分子鑒定，為研究酵母菌打下了基礎。頁碼采用小4號宋體，用“第×頁（共×頁）”的格式，居中，距下邊界15毫米的位置。一般位于正文結尾后下隔2行，居中，采用小3號黑體，字與字之間空半格，與參考文獻目錄間空小四單倍行距。如距離小，可以另起一頁。參 考 文 獻1 周世寧,陸勇軍,杜揚.木聚糖降解菌的篩選和木聚糖酶性質的研究J.中山大學學報,1996,35(1):91-96.參考文獻目錄標引序號用阿拉伯數字、方括號括住，按在正文中出現的先后順序排列，序號與內容間空半格，內容為小4號仿宋體，20磅行距，左頂格，拐行時與

17、序號后文字齊，半角標點。作者3人以下全部寫出，中間用逗號隔開，3人以上用 “第一作者，等”。2 黃云紅,等.木聚糖酶高產微生物的篩選和鑒定J.江西師范大學學報,2002,26(3):245-248.3 王辰,白逢彥.海南熱帶雨林腐木上酵母菌物種多樣性研究J.菌物學報,2009,28(3):354-362.4 國春艷.酸性木聚糖酶產生菌的篩選及酶學性質分析J.中國農業科學,2010,43(7):1524-1530.5 孫豐慧,李安明.耐堿性木聚糖酶產生菌的篩選及發酵條件研究J.應用與環境生物學報,2008,14(3),436-439.文獻題目后應有相應的標識。如期刊J,著作M,學位論文D,報紙N

18、,專利P等。6 濮智穎.酸性木聚糖酶產生菌產酶條件及酶學性質研究J.陜西教育學院學報,2008,24(2):101-105.7 陳紅歌. 酸性木聚糖酶產生菌的篩選及產酶條件J.微生物學報,1999,39(4):350-354.8 Anthony T,Gunasekaran P,Raj K C,Rajendran A,Gunasekaran P.Inhibition of pro- teases during fermentation improves xylanase production by alkali tolerant Aser- perillus fumigatus AR1J.Jou

19、rnal of Bioscience and Bioengineering,2003,96(4): 394-406.9 Fukusaki E ,Panbangred W.The complete nucleotide sequence of the xylanase gene of Ba-cillus pumilusJ.Febs Letters,1984,171(2):197-201.10 周德慶.微生物學實驗手冊M.上海:上海科學技術出版社,1986:197-231.年，卷號（期號）：起止頁碼等信息應齊全。沒有卷號可不標。著作可只標出出版年份。作者用小四號Time New Rome體、“姓”

20、用大寫字母拼寫，“名字”的第一個字母用大寫，其余小寫，兩字者加連字符。Selection and Molecular Identification of英文標題用四號Time New Rome體、加粗、行距22磅，單詞首字母大寫（介詞和連詞除外），與姓名之間空小四單倍行距。如頁面距離太小，可放到下一頁。Xylan-degrading YeastGUAN Wei-weiAbstract: Sixteen Xylan-degrading strains are filtered out by enriching and separating from the rot wood gathered from the Mountain BaoTianMan. Using dye Congo red staining on strains, six Xylan-degrading strains are selected by observating the transparent circles size of these strains. Six strains are cultured in the