1、.實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 粗糙鏈孢霉生活史及雜交粗糙鏈孢霉生活史及雜交.一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 粗糙鏈孢霉屬于真菌中的子囊菌綱。粗糙粗糙鏈孢霉屬于真菌中的子囊菌綱。粗糙鏈孢霉的菌絲體是鏈孢霉的菌絲體是單倍體單倍體（n=7n=7），每一菌絲），每一菌絲細(xì)胞中含有細(xì)胞中含有幾十個(gè)細(xì)胞核幾十個(gè)細(xì)胞核。由菌絲頂端斷裂形。由菌絲頂端斷裂形成分生孢子。成分生孢子。 分生孢子有兩種，小型分生孢子中含有一分生孢子有兩種，小型分生孢子中含有一個(gè)核，大型分生孢子中含有幾個(gè)核。分生孢子個(gè)核，大型分生孢子中含有幾個(gè)核。分生孢子萌發(fā)成菌絲，可再生成分生孢子，周而復(fù)始，萌發(fā)成菌絲，可再生成分生孢子，周而復(fù)始，這是粗糙鏈孢霉的這是

2、粗糙鏈孢霉的無(wú)性生殖無(wú)性生殖過(guò)程。過(guò)程。.鏈孢霉（鏈孢霉（Neurospora crassaNeurospora crassa）的生活史）的生活史圖圖8-19. 粗糙鏈孢霉的菌株有兩種不同的接合型，粗糙鏈孢霉的菌株有兩種不同的接合型，用用A,a A,a 或或mt+, mt-mt+, mt-表示，他們受一對(duì)等位表示，他們受一對(duì)等位基因控制。不同結(jié)合型菌株的細(xì)胞接合產(chǎn)基因控制。不同結(jié)合型菌株的細(xì)胞接合產(chǎn)生有性孢子，這過(guò)程稱為生有性孢子，這過(guò)程稱為有性生殖有性生殖。有性。有性生殖可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行。生殖可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行。 一是產(chǎn)生一是產(chǎn)生原子囊果原子囊果，內(nèi)附有產(chǎn)囊體，若，內(nèi)附有產(chǎn)囊體，若另一

3、接合型的另一接合型的分生孢子分生孢子落在這落在這原子囊果的原子囊果的受精絲受精絲上時(shí)，分生孢子的細(xì)胞核進(jìn)入受精上時(shí)，分生孢子的細(xì)胞核進(jìn)入受精絲，到達(dá)產(chǎn)囊體，形成接合型基因的異核絲，到達(dá)產(chǎn)囊體，形成接合型基因的異核體。體。 二是不同接合型的菌株的二是不同接合型的菌株的菌絲連接菌絲連接，兩種接合型的細(xì)胞核發(fā)生融合形成合子，兩種接合型的細(xì)胞核發(fā)生融合形成合子，產(chǎn)生產(chǎn)生子囊果。子囊果。. 其中，其中，1 1 和和2 2 是是未交換的，稱第一未交換的，稱第一次分裂分離子囊；次分裂分離子囊；3-6 3-6 都是發(fā)生交換都是發(fā)生交換的，稱第二次分裂的，稱第二次分裂分離子囊。分離子囊。 因此，統(tǒng)計(jì)第二因此，統(tǒng)

4、計(jì)第二次分裂分離子囊占次分裂分離子囊占總子囊數(shù)的比例，總子囊數(shù)的比例，乘以乘以0.50.5，就可決定，就可決定某一基因與著絲粒某一基因與著絲粒之間的重組值。重之間的重組值。重組值去掉組值去掉% %（即乘以（即乘以100100），即為該基因），即為該基因圖距。圖距。.粗糙鏈孢霉的子囊和子囊型粗糙鏈孢霉的子囊和子囊型.本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用賴氨酸缺陷型賴氨酸缺陷型（記作（記作LysLys- -）與）與野生型野生型（記作（記作LysLys+ +）雜交，得到的子囊孢子分離為）雜交，得到的子囊孢子分離為4 4個(gè)黑的（），個(gè)黑的（），4 4個(gè)是灰的（個(gè)是灰的（- -）。黑的孢子是野生型；賴氨酸缺陷型孢）。黑的孢

5、子是野生型；賴氨酸缺陷型孢子成熟遲，所以呈灰色。根據(jù)黑色孢子和灰色孢子在子子成熟遲，所以呈灰色。根據(jù)黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列順序，可有囊中的排列順序，可有6 6種子囊類型。種子囊類型。 子囊型（子囊型（1 1）和（）和（2 2）的產(chǎn)生如圖。第一次減數(shù)分裂）的產(chǎn)生如圖。第一次減數(shù)分裂（M M1 1）時(shí)，帶有）時(shí)，帶有LysLys+ +的兩條染色單體移向一極，而帶有的兩條染色單體移向一極，而帶有LysLys- -的兩條染色單體移向另一極。的兩條染色單體移向另一極。LysLys+ +/Lys/Lys- -這對(duì)基因在這對(duì)基因在第一次減數(shù)分裂時(shí)分離，稱第一次分裂分離。第二次減第一次減數(shù)分裂時(shí)分離

6、，稱第一次分裂分離。第二次減數(shù)分裂（數(shù)分裂（M M2 2）時(shí)，每一染色單體相互分開(kāi)，形成四分體，）時(shí)，每一染色單體相互分開(kāi)，形成四分體，順序是順序是或或，再經(jīng)過(guò)一次有絲分裂，成，再經(jīng)過(guò)一次有絲分裂，成為（為（1 1）和（）和（2 2）子囊型。形成這兩種子囊型時(shí)，在著絲）子囊型。形成這兩種子囊型時(shí)，在著絲粒和基因?qū)α：突驅(qū)ysLys+ +/Lys/Lys- -間未發(fā)生過(guò)交換，是第一次分裂分間未發(fā)生過(guò)交換，是第一次分裂分離子囊。離子囊。 .圖中（圖中（3 3）和（）和（4 4）的形成。由于）的形成。由于LysLys基因與著絲粒基因與著絲粒間發(fā)生了一個(gè)交換，間發(fā)生了一個(gè)交換，LysLys+ +/

7、Lys/Lys- -在第一次減數(shù)分離時(shí)在第一次減數(shù)分離時(shí)沒(méi)有分離，到第二次減數(shù)分裂（沒(méi)有分離，到第二次減數(shù)分裂（M M2 2）時(shí)，帶有）時(shí)，帶有Lys+Lys+的染色單體才和帶有的染色單體才和帶有Lys-Lys-的染色單體相互分開(kāi)，所的染色單體相互分開(kāi)，所以稱為第二次分裂分離。然后再經(jīng)一次有絲分裂，以稱為第二次分裂分離。然后再經(jīng)一次有絲分裂，形成形成4 4個(gè)孢子對(duì)，順序是個(gè)孢子對(duì)，順序是-或或-。這是第二次分裂分離子囊。這是第二次分裂分離子囊。（5）和（）和（6）子囊型的形成與（）子囊型的形成與（3）和（）和（4）類似，）類似，也是兩個(gè)染色單體發(fā)生了交換，不過(guò)交換不是發(fā)生也是兩個(gè)染色單體發(fā)生了

8、交換，不過(guò)交換不是發(fā)生在第在第2條染色單體與第條染色單體與第3條染色單體之間，而是發(fā)生條染色單體之間，而是發(fā)生在在1，3或或2，4兩條染色單體之間。兩條染色單體之間。 .粗糙鏈孢霉粗糙鏈孢霉lys+與與lys-雜雜交子囊孢子的排列順序交子囊孢子的排列順序(1)、(2)為非交換型為非交換型(3)、（、（4)、(5)、(6)為交換型子囊為交換型子囊(7)、（、（8)、(9)、(10)是由轉(zhuǎn)換造成的異常比例是由轉(zhuǎn)換造成的異常比例.二、二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1 掌握粗糙鏈孢霉的雜交技術(shù)；掌握粗糙鏈孢霉的雜交技術(shù)；2 2 統(tǒng)計(jì)雜交結(jié)果，計(jì)算基因圖距。統(tǒng)計(jì)雜交結(jié)果，計(jì)算基因圖距。. 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)

9、材料 粗糙鏈孢霉野生型菌株，粗糙鏈孢霉野生型菌株，Lys+,Lys+,接合型接合型A.A.粗糙鏈孢霉賴氨酸缺陷型菌株粗糙鏈孢霉賴氨酸缺陷型菌株Lys-,Lys-,接合型接合型a.a. 四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品 1.1.器具：顯微鏡，鐘表鑷，解剖針，接種器具：顯微鏡，鐘表鑷，解剖針，接種針，載玻片，試管，培養(yǎng)皿。針，載玻片，試管，培養(yǎng)皿。2.2.藥品：藥品： 次氯酸鈉。次氯酸鈉。. 五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟 1 1、菌種活化：、菌種活化：把野生型和缺陷型菌種從冰箱取出，把野生型和缺陷型菌種從冰箱取出，分別接在兩支土豆培養(yǎng)基試管斜面上，分別接在兩支土豆培養(yǎng)基試管斜面上， 2828O O

10、C C溫箱培養(yǎng)天。培養(yǎng)到菌絲上部有分生孢子溫箱培養(yǎng)天。培養(yǎng)到菌絲上部有分生孢子產(chǎn)生。產(chǎn)生。、雜交：、雜交：（）同時(shí)在雜交培養(yǎng)基上接種兩親本菌株的分生（）同時(shí)在雜交培養(yǎng)基上接種兩親本菌株的分生孢子或菌絲，孢子或菌絲，25 25 O OC C溫箱進(jìn)行混合培養(yǎng)。注意要貼溫箱進(jìn)行混合培養(yǎng)。注意要貼好標(biāo)簽，寫(xiě)明親本菌株及雜交日期。好標(biāo)簽，寫(xiě)明親本菌株及雜交日期。（2 2）雜交后天就能看到許多棕色的原子囊果）雜交后天就能看到許多棕色的原子囊果出現(xiàn)，以后原子囊果變黑變成子囊果。出現(xiàn)，以后原子囊果變黑變成子囊果。（3 3）在天左右，就可在顯微鏡下觀察。）在天左右，就可在顯微鏡下觀察。. 另外一種方法：另外一種

11、方法：在雜交培養(yǎng)基上接種一個(gè)親在雜交培養(yǎng)基上接種一個(gè)親本菌株，本菌株，25 OC培養(yǎng)天后即有原子囊果出培養(yǎng)天后即有原子囊果出現(xiàn)。同時(shí)準(zhǔn)備好另一親本菌株的分生孢子，懸現(xiàn)。同時(shí)準(zhǔn)備好另一親本菌株的分生孢子，懸濁于無(wú)菌水中（近于白色的懸濁液），將此懸濁于無(wú)菌水中（近于白色的懸濁液），將此懸濁液加到形成原子囊果的培養(yǎng)物表面，使表面濁液加到形成原子囊果的培養(yǎng)物表面，使表面基本濕潤(rùn)，繼續(xù)基本濕潤(rùn)，繼續(xù)25OC培養(yǎng)。原子囊果在加進(jìn)分培養(yǎng)。原子囊果在加進(jìn)分生孢子一天后即可開(kāi)始增大變黑成子囊果，生孢子一天后即可開(kāi)始增大變黑成子囊果，天后即成熟。天后即成熟。、顯微鏡觀察步驟：、顯微鏡觀察步驟：（）在長(zhǎng)有子囊果的試

12、管中加少量（）在長(zhǎng)有子囊果的試管中加少量無(wú)菌水無(wú)菌水，搖，搖動(dòng)片刻，把水倒在空三角瓶中，加熱煮沸，以動(dòng)片刻，把水倒在空三角瓶中，加熱煮沸，以防止分生孢子飛揚(yáng)。防止分生孢子飛揚(yáng)。.（）取一載玻片，滴一滴（）取一載玻片，滴一滴次氯酸鈉次氯酸鈉，然后用然后用接種針接種針挑出子囊果放在載玻片上，挑出子囊果放在載玻片上，用另一用另一載玻片載玻片蓋上，用手指壓片，將子蓋上，用手指壓片，將子囊果壓破，置顯微鏡下（倍）囊果壓破，置顯微鏡下（倍）檢查，即可見(jiàn)到個(gè)子囊。檢查，即可見(jiàn)到個(gè)子囊。（3）最后用過(guò)的針及玻片要用開(kāi)水煮過(guò)洗最后用過(guò)的針及玻片要用開(kāi)水煮過(guò)洗凈。凈。. （4）在顯微鏡下觀察記錄子囊孢子在子囊中的排列順在顯微鏡下觀察記錄子囊孢子在子囊中的排列順序，將結(jié)果記入下表。序，將結(jié)果記入下表。紅色鏈孢霉性狀遺傳雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果紅色鏈孢霉性狀遺傳雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果子子 囊囊 類類 型型子子 囊囊 數(shù)數(shù)非交換型非交換型（1 1）（2 2）交換型交換型（3 3）（4 4）（5 5）（6 6）合計(jì)合計(jì)其它類型其它類型.鏈孢霉的子囊果和子囊鏈孢霉的子囊果和子囊(a)成熟的子囊果；成熟的子囊果；(b)散開(kāi)的子囊散開(kāi)的子囊 交換型子囊交換型子囊交換型子囊交換型子囊未交換型子囊未交換型子囊.交換型子囊交換型子囊未交換型子囊未交換型子囊未交換型子囊未交換型子囊.六、作業(yè)：