1、間期雙色雙融合熒光原位雜交監測慢性髓系白血病異基因造血干細胞移植后bcr/abl融合基因            間期雙色雙融合熒光原位雜交監測慢性髓系白血病異基因造血干細胞移植后bcr/abl融合基因    2008-5-9 11:57:19                

2、60;                                作者：錢思軒，李建勇，張閏，洪鳴，仇海榮，李麗，徐衛，盛瑞蘭，吳漢新        【摘要】  本研究探討bcr/abl雙色雙融合

3、熒光原位雜交（DD-FISH）的敏感性及臨床應用價值。對19例慢性髓細胞白血病（CML）異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）后微小殘留病灶（MRD）用DD-FISH進行監測，同時與常規細胞遺傳學（CC）、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)結果相比較。樣本取自骨髓，少數來源于骨髓片或外周血。結果表明：14例CML患者在Allo-HSCT后CC顯示持續正常供者核型，RT-PCR轉為陰性，移植2月后均為完全供者嵌合（DC），DD-FISH檢測結果持續為陰性，平均隨訪11.25月，MRD無增加。1例CC及RT-PCR陰性，而性染色體FISH為混合嵌合，DD-FISH陽性，監測無MRD增加，臨床

4、未治療，疾病穩定。3例骨髓復發患者的DD-FISH及性染色體FISH均提示MRD明顯增加，RT-PCR轉為陽性，卻只有1例CC異常，供者淋巴細胞輸注（DLI）及甲磺酸伊馬替尼治療后均為DC，DD-FISH陰性，RT-PCR陰性。1例骨活檢證實髓外復發患者骨髓或外周血樣本的DD-FISH、CC及PCR均陰性，供受者完全嵌合。結論：間期雙色雙融合FISH可應用于CML異基因造血干細胞移植后MRD的監測，其操作簡易快速，靈敏度高，且骨髓或外周血均可采用。動態監測能及時發現擴大的白血病細胞克隆。     【關鍵詞】  熒光原位雜交  

5、;  Monitoring of bcr/abl Fusion Gene by Interphase-Dual-Color and Dual-Fusion Fluorescence in situ Hybridization  in CML after Allo-HSCT    Abstract    This study was aimed to investigate the sensitivity and clinical application value of  interp

6、hase-dual-color and dual-fusion fluorescence in situ hybridization (DD-FISH).  The minimal residual disease (MRD) in 19 patients with chronic myelogenous leukemia (CML) after allogeneic hematopoietic stem cell  transplantation (allo-HSCT)  was detected by DD-FISH，and the detected resu

7、lts were compared with those of conventional  cytogenetics (CC) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The samples were collected from bone marrow or  peripheral blood or  smears of bone marrow. The results indicated that 14 out  of 19  patients achieve

8、d and maintained continuous complete molecular remission  after transplantation. In these patients，CC assay displayed normal donor karyotype，result of RT-PCR was negative，complete donor chimerism was detected after  2  months of transplantation，result of DD-FISH was negative，average t

9、ime of the follow-up survey was  11.25 months，MRD did not increase. Results of CC and RT-PCR in 1 patient showed negative，while FISH of sex chromosome showed mixed chimerism，result of DD-FISH was positive，MRD did not increase，no therapy was given for this patiant，clinical state of patient was s

10、table. Three patients with hematological relapse demonstrated obvious increase of MRD detected by DD-FISH and sex FISH，result of RT-PCR was found positive in them，but the abnormal result of CC was observed only in 1 patient. After donor lymphocyte infusion and imatinib mesylate treatment，these 3 pat

11、ients achieved cytogenetic remission again，results of DD-FISH，CC and PCR were negative in them.  DD-FISH，CC and PCR in bone marrow and peripheral blood  from  one patient with extramedullary relapse revealed negative results，and the complete chimerism was found in this patient. 

12、It is concluded that  interphase-dual-color and dual-fusion  fluores- cence in situ hybridization is a more reliably sensitive and practicable method for monitoring MRD in patients with CMLafter allo-HSCT，and can be used in  detection of chromosome sample and blood or bone marrow smea

13、rs. Dynamic detection of bcr/abl fusion gene  level by FISH may  predict disease changes and guide individual therapy.    Key words  FISH; DD-FISH，CML，allo-HSCT; bcr/abl fusion gene; MRD        異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）是目前治愈慢性髓細胞白血病（C

14、ML）的有效方法，Ph染色體和bcr/abl融合基因是CML的特征性標志，應用常規細胞遺傳學（CC）及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Ph染色體和bcr/abl融合基因已成為臨床確診CML的重要依據。allo-HSCT后的有效監測關系到能否早期、準確判斷腫瘤負荷并及時給予相應治療。近年來熒光原位雜交（FISH）技術因其簡便、快速及靈敏等優勢逐漸引起人們的重視。我們采用雙色雙融合熒光原位雜交（dual-color and dual-fusion FISH，DD-FISH）動態檢測19例CML移植后的bcr/abl變化，同時與移植后嵌合狀態、CC和RT-PCR的檢測結果進行比較。 

15、;   材料和方法    病例    19例CML系我院2002年6月-2005年5月就診并接受allo-HSCT的患者，CML的診斷及分期標準參照張之南等主編的血液病診斷及療效標準（第二版）。男9例，女10例，年齡16-58歲（中位年齡39歲），慢性期14例，加速期1例，急變期4例，其中3例轉變為急性粒細胞白血病，1例轉變為急性淋巴細胞白血病。    移植時期及方式    15例CML患者在確診后1年內進

16、行allo-HSCT，2例分別在確診后18月、28月進行移植，2例CML的病程超過5年。3例轉變為急性粒細胞白血病患者于allo-HSCT前服用甲磺酸伊馬替尼（格列衛）600 mg/day 1-2月。HLA全相合移植13例，其中2例為非親緣性；HLA半相合移植6例。外周血移植13例，骨髓+外周血混合移植2例，骨髓移植2例，非清髓移植為2例。供受者性別相同者10例，性別不同者9例。19例患者輸入供者單個核細胞平均5.68×108/kg，CD34陽性細胞平均為 4.96×106/kg。    預處理方案   

17、 半相合移植預處理方案為阿糖胞苷+環磷酰胺（CTX）+全身照射（TBI）；全相合移植為CTX+TBI；非清髓移植則為福達華+TBI。移植后每1-3月進行骨髓常規檢查、常規細胞遺傳學檢測、性染色體分析（供受者性別不同者）、短片段串聯重復（short tandem repeats，STR）分析（性別相同者）及RT-PCR和FISH檢測bcr/abl融合基因。    染色體核型分析    所有的骨髓細胞進行直接法及短期培養法制備染色體標本，采用R顯帶技術進行核型分析。核型異常按國際細胞遺傳學命名標準（ISCN

18、1995）進行核型分析。    性染色體雙色間期FISH檢測    X、Y染色體著絲粒特異性DNA探針及方法見文獻。每份間期核標本計數1 000個細胞，并記錄雜交信號。綠色熒光信號（G）為X，橘紅色熒光信號（O）為Y，根據患者核型為XX或XY的細胞百分率大于對照組的(X埂?SD），即確定有無供體源的植入克隆或患者的殘存克隆。    雙色雙融合間期FISH檢測    探針購自美國Vysis公司，BCR探針用SpectrumGreen熒光素

19、標記，ABL探針用Spectrum Orange熒光素標記。具體方法見文獻。每份間期核標本計數500-1 000個細胞，并記錄雜交信號。正常間期核細胞（G1）期將顯示2O2G隨機分散的4個雜交信號。2個綠色信號（G）為22號染色體的bcr基因所發出的熒光。2個橘紅色信號（O）為9號染色體的abl基因所發出的熒光。陽性細胞：間期核細胞將顯示1O1G2F雜交信號。1G為未發生易位的22號染色體上的bcr基因發出的熒光；1O為未發生易位的9號染色體上的abl基因發出的熒光；1個紅綠融合信號（F）為融合基  3       

20、0;                               間期雙色雙融合熒光原位雜交監測慢性髓系白血病異基因造血干細胞移植后bcr/abl融合基因    2008-5-9 11:57:19        

21、;                                         因所發出的熒光，疊加為黃色。    RT-PCR 檢測  

22、;  分離單個核細胞，提取總RNA，進行cDNA合成及PCR擴增，PCR引物序列為bcr引物5 -CTCCAGA CTGTCCACAGCATTCCG-3，abl引物3 -AGACT GAAACTCGGAGTCCCAGAC -5 。2-MG 上游引物：5 -ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3，下游引物：5 -ATCTTCAAACCTCCATGATG-3 。根據bcr/abl不同的拼接方式，可產生168 bp和93 bp兩種擴增帶。然后進行PCR，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察結果。    STR-PCR  &

23、#160; 裂解紅細胞和分離白細胞，將Chalex 100反應液及蛋白酶K與白細胞懸浮液混勻，制成DNA懸液。引物共18對5 3 和3 5 引物，分別為 D12S391、D21S11、D6S477、D7S820、D8S384、D8S1545、FGA、D1S549、D8S1179、D3S1754、D12S375、CSFIPO、TH01、D16S539、VWA、D5S818、D18S535和D3S1358，進行PCR。35個熱循環周期。PAGE電泳讀出條帶。    結果    19例患者移植前細胞染色體核型、

24、DD-FISH及RT-PCR均一致反映bcr/abl的存在。17例清髓性移植后平均14天（10-21天）造血重建，2例非清髓移植者分別于移植后2.5個月和3個月轉為完全供者嵌合（donor chimerism，DC）。造血重建后染色體均為正常核型，供受者性別不同者性染色體FISH檢測為供者型，供受者性別相同者STR呈供者完全嵌合狀態。    19例患者動態隨訪平均13.8個月（4-35個月），其中14例患者隨訪平均11.25個月（4-24個月），移植后腫瘤負荷明顯下降并持續分子生物學緩解，2例患者分別在移植后4個月及13個月因度腸道移植物抗宿主病和敗血癥死亡。微小

25、殘留病灶（MRD）與時間的關系見表1。另5例MRD持續陽性或出現腫瘤負荷的增加（表2）。例1移植后染色體為持續供者型，而性染色體FISH提示穩定的混合嵌合狀態(stable mixed chimerism，SMC)，DD-FISH始終陽性，提示MRD的存在，但無增加趨勢。例2于移植后7.5月骨髓原始細胞達15%，融合基因檢測由陰轉陽性，嵌合比例減少，考慮疾病有進展。例3在移植后100天時骨髓原始細胞達8%，CC正常核型，用保存的骨髓片（骨髓染色體標本遺失）檢測發現性染色體FISH 49.5%供者型，DD-FISH顯示 31.7% 2O1G1F。例4移植后4個月FISH及DD-FISH檢測顯示染

26、色體、性染色體出現異常，確診疾病復發。例5為非清髓移植者，由于移植后骨髓反復干抽，無法進行CC檢查，移植后4個月骨髓原始細胞達10%，考慮疾病進展。后4例均立即給予供者淋巴細胞輸注聯合格列衛治療，均又達完全細胞遺傳學緩解（complete cytogenetic remission，CCR），隨訪至今例3及例4仍為CCR。例5在移植后12月出現骨痛，骨CT提示左髖關節和右肩胛破壞，左髖關節活檢為白血病細胞浸潤，而細胞形態學、染色體、嵌合情況、PCR及bcr/abl定量的監測仍呈持續性穩定，給予格列衛、小劑量化療及局部放療，癥狀改善不明顯，于移植后17個月死亡。例2經DLI治療后腫瘤負荷減少，再

27、達分子生物學緩解，但最終因經濟原因停止治療，移植后14個月死亡。Table 1. Correlation between FISH and the time after allo-HSCT in fourteen patients（略）Table 2. Dynamic detection of cytomorphology，CC，chimerism and FISH in five patients（略）    討 論    CML異基因造血干細胞移植后的MRD是指形態學和細胞遺傳學不能檢出的少量白血病細胞3，并被

28、認為是復發的根源，故在臨床上具有重要的意義。用骨髓涂片、CC及DNA多態性等方法鑒別供、受者細胞敏感性低，而分子技術如PCR及FISH明顯提高了檢測的敏感性，且性染色體FISH間期細胞遺傳學技術廣泛用于檢測異性間移植的嵌合狀態4。我們聯合CC、FISH及PCR技術動態監測19例CML allo-HSCT后的細胞來源及MRD，反映了移植后不同時期的植入情況和MRD的演變過程。        19例患者移植后性染色體或STR-PCR檢測均表明供體源植入成功，腫瘤負荷均明顯下降。其中14例患者移植后染色體始終為正常供者核型，植入穩

29、定，移植2月后呈完全供者嵌合，DD-FISH持續陰性。例1移植后染色體始終為正常供者核型，RT-PCR轉為陰性，供受者穩定混合嵌合（SMC），DD-FISH檢測陽性2次。Radich等5認為，如bcr/abl融合基因2次陽性者復發的風險為78%，1次陽性者為22%，多次檢測陰性者為3%。而對于移植后持續為SMC（供者細胞達80%以上）的患者，同樣預示著疾病穩定6。所以例1如出現MRD增加趨勢時，臨床上應給予及時治療。        在復發早期進行免疫（如DLI）和藥物（格列衛）治療能取得較好療效7，8。例2、3各在移植后的7

30、.5個月、100天發現供體源性染色體比例下降，分別為96.0%和49.5%，bcr/abl陽性細胞分別為0.8%和31.7%，而骨髓原始細胞及CC未發現異常。例4移植后的4個月CC為t(9;22)復雜核型，供體源核型及bcr/abl陽性細胞分別為36.4%，RT-PCR轉為陽性。該3例患者均立即給予DLI及聯合格列衛治療，結果供體源性染色體比例明顯上升，bcr/abl陽性細胞下降為0，RT-PCR又轉為陰性。由此可見動態監測DD-FISH能準確地反映體內殘存的bcr/abl陽性細胞量的動態變化。巢式PCR可以檢測到10-6的bcr/abl細胞，移植后早期(9個月內)RT-PCR陽性并不增加復發

31、的危險，而1年后RT-PCR陽性則預示著復發9。雖RT-PCR的敏感性高于FISH，但FISH技術比RT-PCR方法更能反映微量腫瘤克隆的動力改變，而這點在長期隨訪中顯得尤為重要10。        例5為CML加速期合并骨髓纖維化，服用格列衛控制病情后進行同性別間的非清髓性移植。移植后4個月發現骨髓原始細胞達10%，由于同期缺少CC及DD-FISH檢測的結果，故于格列衛及DLI治療后用骨髓或外周血標本進行DD-FISH及RT-PCR監測，隨訪至移植后15個月，未發現MRD增加。但該例患者在移植后12個月出現骨痛，骨活檢證實

32、為CML髓外復發。這提示骨髓及外周血的bcr/abl基因及RT-PCR結果并不能反映出髓外的病變。        本組的檢測標本多數來源于骨髓，例5因骨髓易干抽或稀釋而采用外周血標本或骨髓片。結果表明，標本的來源并不影響監測MRD。Fuehrer等10認為，以涂片進行FISH監測可作為干細胞移植后臨床的常規監測，而且凍存的涂片并不影響檢測結果。至于嵌合狀態的檢測，骨髓樣本的敏感性略高于外周血。        Lion等11認為，bcr/abl細胞的消除可導

33、致殘留克隆的最終完全根除，而少量恒定不變的bcr/abl提示存在著無致瘤潛能的長期活存的T細胞、B細胞等記憶細胞，也可能反映被抑制的惡性克隆。DD-FISH檢測結果陽性提示患者體內存在著bcr/abl細胞，但不能確定其是否具有增殖能力。Chomel等12用FISH及定量RT-PCR方法監測21例CCR的CML，發現當bcr/abl融合基因1%-12%時，定量RT-PCR呈陰性或弱陽性，長期穩定CR者bcr-Abl/abl0.01%。故主張對于長期CR的CML患者，應該用FISH評價MRD，而用定量RT-PCR估計是否將復發。      

34、;  STR-PCR與FISH方法可以互補，然而其敏感性比性染色體FISH低5%10，本組同性別移植者采用STR-PCR判斷嵌合狀態，結果均為完全嵌合，而性染色體FISH卻能反映出異性間移植者供受者細胞的嵌合比例，根據其量的變化可以推斷出腫瘤細胞增殖的情況，這對指導臨床治療是極其重要的。        綜上所述，CC、FISH、RT-PCR技術已常規用于CML移植后MRD的監測，其敏感性順次遞增。而FISH技術不但操作簡便，樣本要求低，骨髓、外周血或涂片均可檢測，而且從動態隨訪結果中能判斷出腫瘤細胞動力學改變，從而

35、能及時指導臨床治療。    【參考文獻】  1李建勇，過宇，薛永權等. 雙色熒光原位雜交技術在異性間造血干細胞移植中的應用. 中華血液學雜志，2000，21:429-4302李建勇，潘金蘭，吳亞芳 等. 間期熒光原位雜交技術檢測急性粒-單核細胞白血病inv(16) . 中華血液學雜志，2002; 23: 30-323Branford S，Hughes TP，Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is

36、 a reliable alternative to bone marrow cytogenetics. Br J Haematol，1999;107: 587-5994Palka G，Stuppia L，Di-Bartolomeo P，et al. FISH detection of mixed chimerism in 33 patients submitted to bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant，1996; 17: 231-2365Radich JP. Molecular measurement of minima

37、l residual disease in Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol，2002; 15: 91-1036Lawler M. Prospective chimerism analysis，the time is now but can we respond? Leukemia，2001; 15: 1992-19947Olavarria E，Ottmann OG，Deininger M，et al. Response to imatinib in patient

38、s who relapse after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia. Leulemia，2003; 17: 1707-17128Savani BN，MonteroA，Kurlander R    3                         

39、;              間期雙色雙融合熒光原位雜交監測慢性髓系白血病異基因造血干細胞移植后bcr/abl融合基因    2008-5-9 11:57:19                                                 ，et a