1、雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗的研究收稿日期：2009-09-17修回日期：2009-10-20公金項0:科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新*.（00026231101115）秦玉明，王利永，朱良全，王棟（中國善醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）摘要：應(yīng)用雞傳染性支氣管炎病毒（H%株）與不同耐熱保護劑配方和凍干曲線進行篩選。結(jié)果表明：采用凍干曲線2和耐熱保護劑WXS凍干雞傳染性支氣管炎病毒Hu弱毒疫苗效果最佳。試制耐熱活疫苗3批，其各項檢驗均符合要求。耐老化試臉表明：經(jīng)過371放置10d的每羽份病毒含量下降0.0.8個滴度，每羽份病毒含量達10"1（戶EID*保存期試驗表明:281:保存24個月

2、疫苗每羽份病毒含量下降0.4-0.6個滴度，每羽份病毒達EIDo疫苗28P保存24個月后效檢抗體水平達到1：1A1：32。免疫持續(xù)期試臉表明：免疫21日齡SPF雞，6個月后血清中和抗體效價達到1：321：6牝田間試驗表明臨床觀察無不良反應(yīng)，安全有效。特異性試驗表明耐熱活疫苗抗原性不變。耐熱保護劑生物學(xué)和理化特性表明保護劑安全、穩(wěn)定，室溫保存期達3個月。關(guān)鍵詞：耐熱保護劑；雞傳染性支氣管炎病毒（H於株）；活疫苗StudyonThermo-tolerantLivingVaccineofAvianInfectiousBronchitis*QINYuming,WANGLiyong.ZHULiangqu

3、an,WANGDong*通訊作者,Email：wangdongQINYuming,WANGLiyong.ZHULiangquan,WANGDong*通訊作者,Email：wangdong(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081)Abstract：Avianinfectiousbronchitisvirus(IBV)attenuatedstrain(HJ2)wasselectedbyfreeze-dryingexperimentsblendingwithdifferentsuspendingmediaandlyophilizatio

4、ncurves.Tlie1BVattenuatedstrain(H>j)choosedbyWXSandlyophilizationcurve2wasmostfavorable.Threebatchesofthermo-tolerantlivingvaccineofIBV(HQproducedbyWXSandlyophilizationcurve2weretestedeligible.Theheat-resistingtestshowedthatthetiterofvirusreduced0.6to0.8EIDjoperdoseafterstoringat37幻for10daysandst

5、illremainedIO47to10s1EID”perdose.Theexperimentofthepreserverperiodreflectedthatthetiterofvimsreduced0.4to0.6EIDperdoseafterstoringat4°Cfor24monthsandstillremained10*1toIO41EID”perdose.Thetiterofneutralizationseraantibodyremained1：I6to132afterstoringat2to8丁for24months.Theimmunitylastingtestindic

6、atedthatimmunizingSPFchickensat21daysage,thetiterofneutralizationseraantibodyreached132to1：64after6months.Thefieldlestshowedthatthermo-lolcrantlivingvaccineofIBV(H52)wassafeandeffective.ThespecificitytestshowedthatinfectiousbronchitisstandardpositiveserumcanspeciallyidentifyitThebiologicalcharacters

7、andphysical&chemicalcharactersrevealedthethermo-tolerantstabilizerwassafeandstable,andcouldbestoredatroomtemperatureforthreemonths.Keywords:thermo-tolerantstabilizer；avianinfectiousbronchitisvimsattenuatedstrain(Hn);livingvaccine雞傳染性支,管炎凍干活疫苗是我國目前使用量較大的禽用疫苗。其產(chǎn)品要求在-151保存和運輸，就我國目前基層縣、鄉(xiāng)、村的防疫條件而言，實際

8、上很難完全達到此條件。凍F活疫苗在溫差比較大的環(huán)境下運輸、保存和使用往往造成病毒失活，免疫效力降低。而同類進口產(chǎn)品均已實現(xiàn)在281保存，有效期達24個月，因此迫切需要研究一種新型的耐熱凍干保護劑，提高國產(chǎn)常規(guī)疫苗的耐熱性能。本研究以雞傳染性支氣管炎病毒Ek株為模型，進行了比較試驗，現(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。1材料雞傳染性支氣管炎病毒Ha株、檢驗用強毒M41株、中和試驗標(biāo)準(zhǔn)毒為MN株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；7、14和21日齡，雞，10日齡SPF胚購于北京市實驗動物中心；常規(guī)的雞傳染性支氣管炎Ha株活疫苗3批，購于北京市獸醫(yī)生物藥品廠（批號為1999-107-4.1999-107-5.1999-10

9、7-6）；進口雞傳染性支氣管炎凍干活疫苗為荷蘭英特威公司生產(chǎn)（批號為03-1999.43）；雞傳染性支，管炎病毒陽性血清購口中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。無萌檢驗用硫乙酬酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪豚瓊脂（G.A）和葡菊糖蛋白豚湯（G.P）購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基室。支原體檢驗用Frey氏培養(yǎng)基均由本實驗室制備°儀器設(shè)備為凍干機（Edwards公司，Lyoflex2.0）.水分測定儀（METTLERTOLEDO）、76-1型高頻電火花真空度測定儀。2方法2.1制苗用毒液的制備按中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（以下簡稱規(guī)程方法進行）。2.2耐熱凍干保護劑篩選和凍干曲線優(yōu)化在不同保護劑基質(zhì)與病毒相

10、容性研究的基礎(chǔ)上，采用3種不同配方耐熱保護劑（WXS、AZW.BZW）和2種凍干曲線分別凍干，凍干后再進行耐老化試驗和物理性狀與水分含拈測定，篩選出最佳保護劑配方和凍干曲線。按照篩選出的最佳保護劑配方和優(yōu)化的凍干曲線試生產(chǎn)3批雞傳染性支氣管炎（HQ耐熱活疫苗，按規(guī)程進行無菌檢驗、支原體檢驗、鑒別檢驗、外源病毒檢驗、安全性檢驗、效力檢驗、剩余水分和真空度等常規(guī)項目檢驗。凍干曲線1：產(chǎn)品-5P進箱,-40%：維持4h,產(chǎn)品由-40P升至-10%：維持10h,板層溫度提高到28P,全程24h。凍F曲線2：產(chǎn)品CH5K進箱，以每分鐘1%：的速度降至-4（）P或者以下，維持4h,板層溫度控制在-10X2

11、,維持1416h,以每2h升溫10忙,板層溫度在25專維持6h出箱，全程30-32h0耐老化試驗對實驗室制備的3批疫苗，毒批隨機抽取疫苗1（）瓶，其中5瓶測疫苗效價，另外5瓶置37%：保存10d,按規(guī)程要求進行病毒含量測定，確定疫苗的熱穩(wěn)定性。同時將3批常規(guī)雞傳染性支氣管炎活疫苗（H52株）及1批進口疫苗作為對照。2.3 保存期試驗對實臉室制備的3批疫苗置28I分別保存6、12、18、24個月，然后按規(guī)程要求進行病毒含量測定，確定其穩(wěn)定性。2.4 免疫效力檢驗對實驗室制備的3批疫侑在28P保存24個月后免疫SPF雞，每批疫苗均滴鼻法免疫21日齡的SPF雛雞10只，每只雞1個使用劑量。在免疫14

12、d后采血并分離血清，按規(guī)程”:要求測定血清的中和抗體效價。2.5 免疫持續(xù)期試驗將實驗室制備的3批雞傳染性支汽管炎（H慝株）耐熱活疫苗和常規(guī)國產(chǎn)H52疫苗（批號為1999-107-5）分別免疫21日齡SPF雞6個月后采血，分離血清。按規(guī)程要求測定血清的中和抗體效價。2.7特異性試驗將實驗室制備的3批疫苗，每批分別抽取5瓶.用生理鹽水稀釋至0.1只份/0.1mL,與等成抗雞傳染性支氣管炎特異性血清混合，在251作用lh,分別于尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個，每胚（）.2niLo耐熱保護劑的生物學(xué)和理化特性測定將耐熱保護劑WXS在25P下保存30、60、90d,測其氨基氮的含量、pH值，及其

13、凍干活疫苗在凍干前、后疫苗病毒滴度的變化和耐熱性能。2.8 田間試驗選擇吉林、廣東、夭津等3個省份不同雞場3.7萬只雞，用本實驗室制備的雞傳染性支7管炎耐熱活疫苗按瓶簽要求稀釋，進行飲水免疫，并進行臨床追蹤觀察。3結(jié)果耐熱凍干保護劑的篩選和凍干曲殘優(yōu)化結(jié)果雞傳染性支氣管炎（HQ毒株采用WXS配方耐熱保護劑與優(yōu)化的凍干曲線2,預(yù)凍效果最好，凍干后外觀不結(jié)晶，37%：保存10d也不萎縮，符合生物制品物理性狀的要求。其它2種配方凍干后外觀已經(jīng)不合格，故未進行病毒含址的測定。將外觀合格的產(chǎn)品進一步進行耐老化試驗，用WXS配方制備的疫苗病毒滴度下降較小,表明其耐熱性能更佳，具體見表lo表1耐熱凍干保護劑

14、的篩選和凍干曲線優(yōu)化結(jié)果>±：表榆狷保護刑種類凍干曲城1流干曲線2潦干后37P10d凍干后37110d效力外現(xiàn)效力外觀效力（EID、/只）外觀效力（EIDJ只）外觀WXS有少量結(jié)晶表面有片狀物.部分要爆10”未見堵肝1O5*不要煽BZW.J11/2見結(jié)冊表面下凹.大部分萎縮1儼上1/3結(jié)晶表而平坦10”大部分羲縮AZW上1/3結(jié)品表面卜凹大部分要縮IO1,上1/3結(jié)品表面下凹泌、大邠分英縮芥慵牛奶.上1/3結(jié)晶嚴(yán)重萋給10*'未見結(jié)晶1伊嚴(yán)柬萎娜3.1 疫苗常規(guī)檢驗結(jié)果采用WXS配方耐熱保護劑和優(yōu)化的凍干曲線2,制備的3批雞傳染性支氣管炎病毒（H&株）耐熱活疫苗

15、（批號為9901.9902.9903）進行無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、安全檢驗、剩余水分含量測定和真空度檢驗等常規(guī)檢驗，結(jié)果均合格，具體見表2。表23批疫苗的常規(guī)檢驗結(jié)果批號物理無南支原體外源病安全剩余夏空效力檢驗性狀檢臉檢驗毒檢驗檢驗水分度（E1DJ只）9901微紅色疏無菌陰性陰性10/101.99%合格1O*1松海綢狀健活9902繳紅色成無的陰性陰性9/101.87%合格10*'松海綿狀健活*9903微紅色跋無菌陰性陰性9/101.75%合格10*7松海綿狀他活、注：A24h內(nèi)死亡3.2 耐老化試臉結(jié)果實驗室制備的3批耐熱凍干活疫苗和荷蘭的英特威公司與國內(nèi)同類產(chǎn)品同時進行耐

16、老化試驗。實驗室制備的3批疫苗凍干后笛羽份病毒含量達EIDso.37r保存10d,其疫苗每羽份病毒含量下降了0.6F.8個滴度。國內(nèi)同類常規(guī)牛奶、脫脂牛奶保護劑的疫苗則分別下降了2.42.6個滴度。國外進口1批疫苗下降1.2個滴度（見表3）。3.4保存期試驗結(jié)果實驗室制備的3批耐熱活疫苗于2TP保存«33批疫苗耐老化試驗培果EID./只批號疫苗毒價37r10d疫苗毒價990110*'10°990210°10,99903i時V英特威10°10”1999-107-410°10*1999-107-510°10”1999-107-61

17、0*'10°24個月后，每羽份病毒含噠僅下降0.&W.8個滴度,每羽份病毒含量仍達到10'10"EID,）,符合規(guī)程要求（每羽份病毒NIO"EIDso）。國內(nèi)常規(guī)疫苗在28K保存6個月就已經(jīng)不合格。國外同類產(chǎn)品保存24個月后每羽份病毒含量也僅下降0.6個滴度（見表4）。表43批疫苗保存期結(jié)果EID/只28P（月）注：未佐測批號原始效價6121824990110*'10"104'10°10°990210"104,104'10°10*'990310。10*710&

18、#176;10°英特威10*7葉1儼10*'1999-107-410°101'101*.1999-107-510。10*'爐1999-107-6to*11尹1O1'.*3.5免疫效力檢驗結(jié)果實驗室制備的3批雞傳染性支氣管炎Hsz耐熱活疫苗經(jīng)28P保存24個月后，經(jīng)血清中和抗體效價檢測仍達到1：16,均達到規(guī)程要求（>1：8）的質(zhì)場標(biāo)準(zhǔn)，對免疫雞群仍起到很好的保護作用（見表5）。表53批疫苗的效力檢驗結(jié)果.28r24個SPF格綸唆免檢利仙、途捋采時間.血清中和抗體效價供'月（EID»/H）（只）9901Wli1021IO

19、*5EIIX/只的免疫后1:16-3299021()*'|>21梅森液滴昴免疫14d1：16990310*'10211：162.6 免疫持續(xù)期試驗結(jié)果用實驗室制備的3批用傳染性支y管炎耐熱活疫苗免疫雞,6個月后采集血清其中和抗體效價測定結(jié)果均N1：16,與常規(guī)對照疫苗相一致。具體結(jié)果見表6。哀63批疫苗血清中和抗體效價測定結(jié)果批號原始牧價（EIIX/JI）采血H齡dliil中和SPFK(個)(ml.)中相抗體結(jié)果99011(尸2(K)湘峰和1：1612«».299021OV稀#分別，120.2>1：169903i(r100Eld中fB12().2

20、耕毒對照66/6死r.正常對照66/6ft!活田間試驗檢測姑果3批疫苗在3個省份田間試驗中臨床觀察和病例剖檢結(jié)果表明雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗對免疫雞群安全、有效、質(zhì)里可控。具體結(jié)果見表7。表73批疫苗田間試驗結(jié)果批號接沖途徑數(shù)M效梨疑察吉林990130飲水2、只好排免校后35.Ed.分別利校廣東990235挾水0.9)1只5只妗.嗾頭、氣管、支丁管無水天津990330伏水<».«萬只腫、出血.玷液地務(wù)等病變."生產(chǎn)網(wǎng)期未見界常。it明：將傳染性支'（管炎耐熙活授尚*免疫相安全.有效3.8特異性試臉結(jié)果將實驗室制備3批雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗稀釋后與等破陽性血清中和，再接種SPF雞胚24h后均存活，證明特異性檢噩合格（見表8）。3.9 耐熱保護劑生物學(xué)和理化特性的測定結(jié)果將篩選好的WXS配方在25P保存30.60和90d,其理化特性未發(fā)生改變,再與雞傳染性支氣管炎病毒制備的耐熱疫苗比較其耐熱性能未發(fā)生明顯改變，安全性能沒有改變，均符合規(guī)定，其體結(jié)果見表9。表83批疫苗的特異性檢測皓果ii：A24h內(nèi)此亡批號凍后穌始效價（EI1WH）中和剖檢"活率99011儼用生埋找水稀仲至成察144h./$9/10*99020.1羽mL.M肝航兒未北失10/10990