1、1 總 RNA 提取(1) 液氮研磨或冰上勻漿實驗材料；先將 1ml Trizol 加到離心管中待用(2) 將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5 min ;打開離心機預冷(3) 力卩200卩氯仿，振蕩15 sec室溫放置3 min，分層； 4°C, 12,000g，離心 15 mi n；(5) 取上清，加500卩異丙醇，混勻，室溫放置10 min;(6) 4°C, 12,000g，離心 10 mi n；(7) 棄上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，離心 5 min ；(9) 棄上清，離心，用槍吸取多余液

2、體，放在超凈臺里干燥后，加50卩L DEPC 水，80°C保存。此操作中所用到的器皿均需經過 DEPC 滅活 RNA 酶處理。提取的總 RNA 需經 RNA 電泳檢測質量，并用紫外分光光度計測定濃度。 OD260 值為核酸的吸 收值，OD280值為蛋白的吸收值，OD260/280值在間一般說明該核酸蛋白含 量在允許的范圍內，可正常使用；此外還有 OD230值為多糖和酚類的吸收值，比 較干凈的核酸OD260/230值能達到2.2左右。RNA濃度計算公式：總 RNA濃度(卩 g/mL =A260 >稀釋倍數 >40。2 反轉錄 /cDNA 第一鏈的合成純化RNA以去除基因組

3、DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reage ntwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行。其體系為：Total RNA1yg5X gDNA Eraser Buffer2yLgDNA Eraser1yLRNase Free dH2O補齊至 10yL條件為： 42oC, 2min；RNA 純化后,即可進行反轉錄。其體系為：5 x PrimeScript Buffer 2( for Real Time)4yLPrimeScript RT enzyme mix I1yLRT Primer Mix1yL上一步的反應液10yLRNase

4、 Free dH2O補齊至 20yL操作條件為：(1) 37oC 放置 15 min；(2) 85oC, 5 sec；(3) 4oC 保存。3 PCR按 TaKaRa公司的 Premix TaqVersion 2.0操作，PCR反應體系如下：Premix Taq25 yL模板5yL引物 1 (10 y M)1 yL引物 2 (10 y M)1 yLddH2O18 yLPCR 反應條件為：94° （預變性 5min; 94°C 變性 30s, 53 °C退 火 30s, 72 °C 延伸30s,循環36次；72°C延伸10min。PCR反應完畢，

5、取反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用 10 yL反應產物）4 基因克隆及測序4.1 PCR 產物切膠回收將 PCR 產物用 1%瓊脂糖凝膠進行電泳， 在紫外燈下觀察并切下預期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割膠回收試劑 盒進行純化，步驟如下：平衡吸附柱：向吸附柱 CB2中(吸附柱放入收集管中)加入 500 Z平衡 液BL , 13,400X g離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集 管中；(2) 按100 mg agarose膠加入100卩L溶液PC,置于50°C中1

6、0 min左右， 中途混勻幾次，至膠完全融化；(3) 將樣品倒入一個吸附柱 CB2 中(吸附柱放入收集管中) ，室溫下 13,400 x g離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(4) 向吸附柱CB2中加入600卩L漂洗液PW (加乙醇)，室溫下13,400x g離 心1 min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(5) 重復上一步驟；將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400x g離心2 min，盡量除去 漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數分鐘，徹底晾干；(7) 將柱子套入一新的滅菌 1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50卩L洗脫

7、緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400x g室溫離心2 min,收集到的洗脫 液即為回收的 DNA 純化液；(8) 取5 Z的純化液體進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測量溶液 中 DNA 含量。4.2目的片段與載體連接(1)膠回收產物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試劑 盒說明書。在滅菌的0.5 mL離心管中配制如下溶液(10卩：回收 DNALigation Solution pMD18-T Vector16°C反應30分鐘，所得產物保存于4°C冰箱備用4.3連接產物轉化 E.coli DH5a(1)將5卩1連接產物加入到100 E.coli

8、DH5a感受態細胞中，輕輕旋轉離 心管混勻內容物，冰上靜置 30 min；42°C水浴熱激轉化90 sec立即放回冰上，放置3 min;(3)每管加入500卩LLB 培養基 (室溫放置)， 37oC 160-180 rpm 振蕩培養 45-60 min，使菌體復蘇并表達抗性基因； 在含有Amp (100卩g/mL的選擇性平板上加入60-100卩L菌液，用無 菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用 Parafilm 膜封好；(5)將培養皿正放，37oC約50 min,待液體全部吸收后，倒置平板繼續培養 10-16 h。4.4轉化子的篩選及鑒定(1) 用無菌槍頭挑取 LB 平板上 3-5個單菌落，分別接種到 3.5 mL LB 液體 培養基 中(含 100 卩 g/mL A