1、基因工程藥物研發(fā)的基本過程 基因工程藥物的研發(fā)分為上游和下游兩個階段：上游階段：主要是分離目的基因、構建工程菌 （細胞）。目的基因獲得 后，最主要的就是目的基因的表達。 選擇基因表達系統(tǒng)主要考慮的是 保證表達的蛋白質的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。此階段的工作主要在實驗室內完成。下遊階段:從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質量控制。 此階段是將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、 商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā) 酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質及裝置的 開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術，生物傳感器等 一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。血管抑制素

2、（an giostat in ,簡稱AGN）是纖溶酶原 的一個酶解片段，相當于其14 Kringle區(qū),具有抑 制內皮細胞增殖、抑制血管生成及抑制多種類型腫 瘤生長和轉移的生物功能，是一種新型血管生成抑 制因子1 , 2 ,對于控制腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、消 化道潰瘍、關節(jié)炎等病理性血管生成具有重要的研 究價值和應用前景PCR產(chǎn)物的T載體克隆（一）重組T質粒的構建一原理外源DNA與載體分子的連接就是 DNA重組，這樣重新組合的 DNA叫做重組體或重組子。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有 Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將 分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA

3、連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌 DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌 DNA連接酶沒有的特性， 即能使兩個平末端的雙鏈 DNA 分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低， 一般可通過提高 T4 噬菌體 DNA 連接酶濃度或增加 DNA 濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化 DNA連接反應分為3步：首先，T4 DNA連接酶與輔因子 ATP 形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有 5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上， 使 DNA 腺

4、苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同 大小的片斷相連。因為 DNA 片斷有兩個端點，所以切割時出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切， 另一種是雙酶切， 這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。 對于單酶切來說， 載體與 供體的末端都相同， 連接可以在任何末端之間進行， 這樣就導致了大量的自連接產(chǎn)物。 為了 減少自環(huán)的高本底， 可對載體進行 5'除磷酸處理， 原理是連接酶只能連接 DNA 片斷的 3' OH 末端與 5'端，所以除磷后載體不會自環(huán)。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5'端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的

5、自 環(huán)造成的高本底。 對于雙酶切來說， 無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)， 能使有效連接產(chǎn)物大大增加。 雙酶切的另一個特點是能將供體分子 定向連接到載體上。連接反應的溫度在 37 C時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不 穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16 C,連接12-16h （過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩(wěn)定。 Taq DNA 酶擴增的 PCR 產(chǎn)物，其 DNA 雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組 T 質粒。二材料與方

6、法1 材料 外源 DNA 片斷2 儀器、用具 移液槍、碎冰3 試劑pMD 18-T Vector ； Ligation buffer ； T4 ligatease； rATP4 方法連接體系如下：16C連接過夜。（二）重組質粒的轉化及陽性克隆的鑒定1 材料E.coli JM109 菌株2 儀器、用具 超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、 1.5ml 離心管、電泳儀、電 泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑（1）CaCI2、LB平板（見附錄）;SOC培養(yǎng)基（見附錄）;SOB培養(yǎng)基（2）RNase A1 ； Buffer S1 ； Buffer S2 ； Buffer S3 ； B

7、uffer W1 ；無水乙醇的 Buffer W2a1電泳緩沖液（TAE ）;溴化乙錠溶液（EB）有毒，小心;瓊脂糖；6 X加樣緩沖液（4）酚；氯仿；異戊醇 ddH2O ; 10 XPCR Buffer （Mg2+ plus） ; dNTP ; M13+ ; M13-; TaKaRa rTaq 酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(1) 取大腸桿菌JM109保存液50 ，接種于4ml LB (或SOB)液體培養(yǎng)基中，37C, 300rpm 振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取 50卩l(xiāng)轉接到新的4ml LB (或SOB)液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng) 3h至OD600=0.350.4，在無菌操作臺上取 1ml菌液

8、于1.5ml離心管中，冰浴 10min。4 °C, 5000rpm離心2min，去上清液。(3) 加入750 預冷的0.1M CaCI2重懸菌體，冰浴 30min。4 C, 5000rpm離心2min，棄上清液。 加入100卩I冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴 2h后，4C保存?zhèn)溆谩?. 重組 DNA 的轉化(1) 將含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37C預熱。 于100卩感受態(tài)細胞中加入 10 連接產(chǎn)物，冰浴 30min。(3)將離心管轉入42 C水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管， 迅速將其放在冰上 2min。 在離心管中加入 SOC培養(yǎng)基300

9、卩,1槍頭混勻，37C、150rpm溫和搖振60min。(5) 將200卩轉化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37C倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進行鑒定。注意事項： 制備感受態(tài)細胞的全部操作均須于冰浴操作,同時注意近火無菌操作,防止感受態(tài)細胞 受雜菌污染。 42C熱處理時很關鍵，轉移速度要快，且溫度要準確。 菌液涂皿操作時,應避免反復來回涂布,因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化,過多的機 械擠壓涂布會使細胞破裂,影響轉化率。3 重組質粒的鑒定方案一 菌落 PCR(1) 制備 PCR 混合液：(2) 用經(jīng)滅菌的10卩槍頭(

10、不用牙簽)挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 蓋上離心管得蓋子,在沸水上溫育 10 min 。 將步驟 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5)按以下條件進行 PCR反應：94C預變性3min ;然后進行30個循環(huán)反應，其溫度循環(huán)條件為：94 C變性1min , 57 C退火1min , 72 C延伸1min ;循環(huán)結束后 72 C再延伸5min。 取5卩l(xiāng) PCR物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。方案二 質粒 PCR1. 堿裂解法少量制備質粒 DNA(1)用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基(含Amp)中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm

11、離心30秒， 棄盡上清。用250 已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細菌沉淀。 加入250卩l(xiāng) Buffer S2溫和但充分地上下翻轉混合4-6次，此步驟不宜超過 5min。*Buffer S2使用后應立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(4) 加入400l Buffer S3溫和地上下翻轉 8-10次，室溫靜置 2min , 14000rpm離心10min。 *若離心后凝結塊未沉淀到離心管底部，應再上下翻轉數(shù)次，12000g離心3min。(5) 將 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，將步

12、中的混合液移入DNA-prep Tube中， 5500rpm 離心 1min。(6) 棄濾液，將 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500 卩 I Buffer W1 , 5500rpm 離心 1min 。棄濾液，將 DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700 已加無水乙醇 的Buffer W2， 5500rpm離心1min，以同樣的方法再用7001已加無水乙醇的 BufferW2 洗滌一次。(8) 棄濾液，將 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中， 1

13、4000rpm 離心 1min。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將 DNA-prep Tube 置于一新的 1.5ml 離心管中，在 silica 膜 中央加入25-301 Eluent或去離子水。(10) 室溫靜置 2 min， 14000rpm 離心 1min 洗脫 DNA。(11) 取5 1L羊品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉化子。2. 抽提純化質粒 DNA 酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質粒 DNA 中殘留的蛋白質。(1) 加 TE 稀釋質粒 DNA 溶液至 3001L。(2) 加等體積的酚 :氯仿:異戊醇( 25:24:1)，震蕩混勻，靜置 3min。(3) 14000rpm

14、離心5min ,吸上清液，加等體積的酚：氯仿:異戊醇(25:24:1 )，混勻，靜置3min。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿：異戊醇(24:1),混勻，靜置3min。(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，加2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后-20C放置15min ,沉淀質粒 DNA 。(6) 14000rpm離心13min,棄上清液，沉淀加入200卩L 70%L醇洗滌一次，室溫干燥，用20去離子雙蒸水溶解質粒DNA沉淀，-20 C保存待用。(7) 取 51l 樣品， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。3. 質粒 PCR(1) PCR 反應體系如下：(2)

15、 PCR擴增反應條件：94C預變性3min ;然后進行30個循環(huán)反應，其溫度循環(huán)條件為: 94C變性1min , 57C退火1min , 72 C延伸1min ;循環(huán)結束后 72 C再延伸5min。(3) 取5 i l PCR物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，方法與試驗二相同。PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，平滑末端連接和粘性末端連接，平滑末端比粘性末端的連接效率要 低很多。平滑末端連接： 載體為平末端，可用 EcoR V 或 Sma I 酶切，同時為了防止載體自連，對載體做了去磷酸處理。PCR產(chǎn)物為磷酸化的平末端產(chǎn)物：一般高保真聚合酶擴增得到，高保真聚合酶有很強的 3't 5'外切

16、酶活性。或將非平末端的 PCR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進行平末端處理。對于平末端的 PCR產(chǎn)物 還需要進行磷酸化處理，使其 5'磷酸化。粘性末端連接：1、 酶切克隆：在 PCR引物的5'端引入與載體匹配，不同識別位點的限制性內酶切位點，載體 使用同樣的限制性內切酶酶切，進行連接，通常可以得到定向克隆的結果。2、 TA克隆：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen 公司（San Diego，CA發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3'末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有 3'T突岀端的載體，在連接酶作用下，可以

17、快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質粒載體的多克隆位點（MCS中。TA克隆沒有方向性。科技名詞定義中文名稱：聚合酶鏈式反應英文名稱： polymerase chain reaction;PCR定義 1：用引物和 DNA 聚合酶進行體外擴增特定的 DNA 區(qū)域的一種技術。所屬學科：生態(tài)學 （一級學科 ） ； 分子生態(tài)學 （二級學科 ）定義 2： 體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術。所屬學科：水產(chǎn)學 （一級學科 ） ；水產(chǎn)生物育種學 （二級學科 ）定義 3：通過 DNA 互補雙鏈解鏈、 退火和聚合延伸的多次循環(huán)來擴增 DNA 特定序列的方法。所屬學科：細胞生物學 （一級學科 ） ；細胞生

18、物學技術 （二級學科 ）定義 4：由穆利斯 （K. B. Mullis） 于1988 年首創(chuàng)的一種在體外模擬發(fā)生于細胞內的 DNA 快速 擴增特定基因或 DNA 序列的復制過程的技術。所屬學科：遺傳學(一級學科)；分子遺傳學(二級學科)本內容由全國科學技術名詞審定委員會審定公布目錄隱藏概述:PCR原理PCR反應體系與反應條件:PCR步驟:PCR檢測:PCR反應特點:PCR的循環(huán)參數(shù)PCR儀器概述:PCR原理PCR反應體系與反應條件:PCR步驟:PCR檢測:PCR反應特點:PCR的循環(huán)參數(shù)PCR儀器* PCR實驗室的建立方法編輯本段概述聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reac

19、tion)，簡稱 PCR，是一種分子生物學 技術，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復制。DNA聚合酶(DNApolymerase I)最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實 用性的Kle nowPCR流程fragmentof E. Coli則是于70年代的初期由 Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性，因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現(xiàn)今所使用的酶（簡稱 Taq polymerase）, 則是于1976年從溫泉中的細菌（ Thermusaquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80

20、年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe提出。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務于 PE公司，因此 PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關的論文發(fā)表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技 術。Mul

21、lis也因此獲得了 1993年諾貝爾化學獎。編輯本段:PCR原理DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱 DNA聚合酶-Taq酶對于PCR的應用有里程碑

22、的意義，該酶可以耐受90 C以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至93 C左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的

23、延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。編輯本段PCR反應體系與反應條件1. 標準的PCR反應體系10 X擴增緩沖 液10卩l(xiāng)4種dNTP混合物200 gl引物10 100gl模板DNA0.1 2 ggTaq DNA聚合酶2.5 glMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水100 glPCR反應五要素

24、：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物（PCR引物為DNA片段，細胞內 DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要 Mg2+）。引物有多種設計方法，與PCR在實驗中的目的決定。但基本原則相同PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu。分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但已發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制緩沖液的成分最為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一

25、般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用 銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應體系確定，除特殊情況外不需調整；輔 助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結構2、PCR引物設計PCR反應中有兩條引物，即 5'端引物和3'引物。設計引物時以一條 DNA單鏈為 基準（常以信息鏈為基準），5'端引物與位于待擴增片段 5'端上游的一小段 DNA序列相同；3'端引物與位于待擴增片段 3'端的一小段 DNA序列互補。引物設計的基本原則 引物長度： 15-30bp，常用為 20bp左右。G+C 太少擴增效果不佳， G+C 過多

26、易5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排3 '端的互補重疊。70%，引物3'末端連續(xù)8個堿 引物堿基： G+C 含量以 40-60% 為宜， 出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC 最好隨機分布，避免 列。 引物內部不應出現(xiàn)互補序列。 兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。 引物 3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇 是 G 和 C 。 引物的 5 '端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光 物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密

27、碼子、終止密碼子等。v 引物設計軟件Primer Premier5.0 （自動搜索） * vOligo6 （引物評價） vVector NTI SuitvDNAsis vOmiga vDNAstarvPrimer3 （在線服務）3、模板的制備PCR 的模板可以是 DNA ，也可以是 RNA 。模板的取材主要依據(jù) PCR 的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌 等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學標本有血斑、精斑、 毛發(fā)等。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS 和蛋白酶 K 處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA 處理。所得

28、到的粗制DNA ，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR 反應模板。4、PCR 反應條件的控制 PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 鎂離子濃度 總量應比 dNTPs 的濃度高，常用 1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA 聚合酶 2.5U （ 100ul ） 引物 濃度一般為 0.1 0.5umol/L 反應溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時間95 C, 30s退火溫度和時間低于引物 Tm值5 C左右，一般在 4555 C延伸溫度和時間72 C, 1min/kb (10kb內)Tm 值=4(G+C)+ 2(A+T)循環(huán)次數(shù)：一般為2

29、530次。循環(huán)數(shù)決定 PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低， 可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的平臺期”。編輯本段PCR步驟標準的PCR過程分為三步：1. DNA變性(90 C -96 C)：雙鏈 DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2. 退火(25 C -65 C)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。3. 延伸(70 C -75 C)：在Taq酶(在72 C左右，活性最佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的 5'

30、;端宀3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些 PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60 C -65 C間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。編輯本段:PCR檢測PCR反應擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關鍵。熒光素(溴化乙錠，EB)染色 凝膠電泳 是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩 聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以 熒光探針 為代表的檢測方法，有逐漸取代電

31、泳法的趨勢。編輯本段:PCR反應特點特異性強PCR反應的特異性決定因素為： 引物與模板 DNA特異正確的結合； 堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； 靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA 聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的 靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其 特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12）量級的起始待測

32、模板擴增到微克（卩g=6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中， PCR的靈敏度可達 3個RFU（空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。簡便、快速PCR反應用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在 24小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及 RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。編輯本段:PCR的循環(huán)參數(shù)1、 預變性（In

33、itial denaturation ）模板DNA完全變性與 PCR酶的完全激活對 PCR能否成功至關重要，建議加熱 時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般 95 C, 30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。3、引物退火( Primer ann eali ng )退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對 PCR的特異性有較大影響。4、引物延伸引物延伸一般在 72 C

34、進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度 較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為 1min/kbp。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。6、最后延伸在最后一個循環(huán)后，反應在 72 C維持5-15分鐘.使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn) 物退火成雙鏈。（四）PCR中的污染和假陽性PCR中污染主要來自1、樣品間交叉污染；2、先前 PCR產(chǎn)物遺留（carry-over ）編輯本段PCR儀器pcr儀器的發(fā)展pcr溫度循環(huán)至關重要，pcr擴增儀各參數(shù)必須準確。自perkin -elmercetus 公司第一

35、臺pcr擴增儀問世以來，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內外生產(chǎn)和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術，并且進一步朝方 便、實用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。為了便于了解和選購適宜的pcr實驗設備，現(xiàn)將部分國內外pcr擴增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu) 缺點。國產(chǎn)1109型dna擴增儀則是用恒溫浴機械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式pcr，方便實用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動控制溫度、時間及循環(huán)數(shù)，可以達到節(jié)省勞動力的目的。在 采用這些儀器作pcr試

36、驗之前，一般均應實測管內溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時管內因熱傳導造成的溫度滯后情況和實際到達的最高、最低溫度，用于修正設計 的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用eppe ndorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度） 的影響， 這對變溫鋁塊式儀器影響更大些。 對于配用制冷機式半導體元件致冷的儀器， 在使用低于室溫的溫度來保冷 pcr 反應后小管時，應注意冷凝水的問題，勿使流入儀 器內浸濕半導體元件而損壞儀器。國內外生產(chǎn)的幾種 dna 擴增儀1109 型 北京新技術所與軍科院聯(lián)合機械臂變溫水浴電子調溫40X0.5ml16400 元 /臺90a/b 型 中科院遺傳所 機械臂變溫水浴電熱14000

37、元 /臺ptc-51a/b 型 軍事醫(yī)學科學院變溫氣流 電子調兼作套式30X0.5ml12000 元 /臺dna thermal cyclerperk in-elmercetus（美）變溫鋁塊 壓縮機致冷48X0.5mlus $ 20000.-thermocycler 6000 180b.braunbiotech（德）變溫水浴98 C四檔電熱 , 自來水冷卻60 x 1.5ml100X 1.5ml180x 1.5mldm 30000.-blockautomatic temperature cy-cler single block twin ericomp inc.（ 美 ）變溫鋁塊 25100

38、 C電熱 , 自來水冷卻29x 1.5ml58x 1.5mlus $4985.-us $7980.-grant autogengrant instrumant ltd（ 美 ）變溫水浴 0 99 C電熱 , 自來水冷卻或加冷循環(huán)器50x 1.5mlor50x 1.5mlus $250. -plusus $ 15.-forrack（x2）techne phc-1phc-2techne ltd.（ 英 ）變溫鋁塊099 C三檔電熱 500w 水冷 100w54x 0.5ml54x 0.5ml24x 1.5ml£ 3383.-£ 3997.-bioovenbiothrm corp

39、（ 美 ）變溫氣流-150 C115v11a200's of 4x 96plateus $ 2990. -trio-thermo-block tb-1biomertra（ 德 ） 半導體變溫220v3X20 管分別控溫dm12900. -micro cycler eeppendorf（ 美 ） 變溫鋁塊220v/100v3X29 管us $ 3500. - PCR 常見問題PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質 量及溴乙錠的使用，

40、PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。 模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消 化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序 亦應 固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不 夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR 失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原

41、因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條 濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成 單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無 條帶，此時做 PCR 有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高， 一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次 凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長 度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+ 濃度： Mg2+ 離子濃度對 PCR 擴增效率影響很大， 濃度

42、過高可降低 PCR 擴 增的特 異性， 濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行 PCR 擴增采用的體積為 20ul 、 30ul 、50ul 。或 100u l ，應用多 大體積進行 PCR 擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小 體積如 20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 PCR 擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有 可能出現(xiàn)假陰性 ;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度 過高影響引物與模板的結合而降低 PCR 擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，

43、檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 PC R 擴增時，擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出 現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段 的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解

44、決：操作時應小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器 材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前， 反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這 些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出 P CR 產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR 方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性 擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完 全互補、或引物聚合形成二聚體。

45、二是 Mg2+ 離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一 來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設 計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93 C變性，65 C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR 擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶 的質量差， dNTP 濃度過高， Mg2+ 濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。 其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃

46、度。適當降低 Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。克隆 PCR 產(chǎn)物1）克隆 PCR 產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？ 最佳插入片段：載體比需實驗確定。1： 1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比 1： 8 或 8：1 也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X 連接液 ,50ng 質粒 DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫 1小時，或 4 C過夜。在這2種溫度下，缺 T- 凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1 小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4 C過夜。2）PCR 產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜

47、帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶 有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？A ）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌 落。B ）轉化完整質粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率。例如，將 1ug/ul 質粒 1:100 稀釋 ,1ul 用于 100ul 感受態(tài)細胞轉化。用 SOC 稀釋 到 1000ul 后，用 100ul 鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生 1000 個菌落。轉化率為： 產(chǎn)生菌落 的總數(shù) /鋪板 DNA 的總量。鋪

48、板 DNA 的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉化用 10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用 1 ng DNA。轉化 率為：1000 克隆 X10 （3 次方） ng /鋪板 1 ng DNA ug=10 （6 次方） cfu/ ug轉化 pGEM-T 應用 10（8 次方） cfu/ ug 感受態(tài)細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。C）如用pGEM-T 正對照，或 PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑（用指定步驟 10 （8 次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶

49、（ M1801 ， M1804 ， M1794 ）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA 連接酶替換。D ）用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 載體，連接 pGEM-T 正對照，轉化高頻率感受 態(tài)細胞（ 10（8 次方） cfu/ug ） ,按照指定的實驗步驟，可得100 個菌落，其中 60%應為白斑，如產(chǎn)生 >20-40 藍斑 , 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。4）對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？A ）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4C過夜。B ）插入片段帶有污染，使3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為

50、此，將插入片段和 pGEM-T 正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重 新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T 或 pGEM-T Easy載體 3'-T 缺失。C ）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV 過度照射，時有發(fā)生。 UV 過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接， DNA 必需重新純化。D ）帶有修復功能的耐熱DNA 聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A ，后者是 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 載體克隆所需。加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端加 A 。詳情查 p GEM-T pGEM-T Easy 載體技術資料

51、（ TM042 ）。E ）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高 頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如 SURE 細胞PCR 反應體系與反應條件標準的 PCR 反應體系：10X擴增緩沖液 10ul4種 dNTP 混合物 各 200umol/L引物 各10lOOpmol模板DNA 0.12ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 1OOulPCR 反應五要素： 參加 PCR 反應的物質主要有五種即引物、酶、 dNTP 、模板 和 Mg2+引物： 引物是 PCR 特異性反應的關鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板

52、 DNA 互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA 序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR 就可將模板 DNA 在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則： 引物長度： 15-3Obp ，常用為 2Obp 左右。 引物擴增跨度：以 2OO-5OObp 為宜，特定條件下可擴增長至 1Okb 的片段。 引物堿基： G+C 含量以 4O-6O% 為宜， G+C 太少擴增效果不佳， G+C 過多易 出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC 最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排 列。 避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體

53、，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物 3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因 末端堿基不配對而導致 PCR 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度 O.1 1umol 或 1O 1OOpmol ，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。酶及其濃度 目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提 純的天然酶，另一種為大腸菌合成的

54、基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應約需酶量 2.5U（ 指總反應體積為 100ul 時 ），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn) 物量減少。dNTP 的質量與濃度 dNTP 的質量與濃度和 PCR 擴增效率有密切關系， dNTP 粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用時應配成 高濃度后，以 1M NaOH或1M Tris。 HCL的緩沖液將其 PH調節(jié)到7.07.5，小量 分裝，-20 C冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在 PCR反應中，dNTP應為50200umol/L ，尤其是注意 4 種 dNTP 的濃度要相等 （等摩爾配制 ），如其中任

55、何一種濃 度不同于其它幾種時（ 偏高或偏低 ），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。 dNTP 能與 Mg2+ 結合，使游離的 Mg2+ 濃度降低。模板 （靶基因 ）核酸 模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之 一，傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標本。 SDS 的主要 功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細 胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白質，特別是與 DNA 結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用 乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR 反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基 因游離，直接用于 PCR 擴增。 RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止 RNase 降解 RNA 。Mg2+ 濃度 Mg2+ 對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時， Mg2+ 濃度為 1.52.0mmol/L 為宜。 Mg2+ 濃度過高，反應特異性降低