1、 湖底沉積物中有機磷的釋放1、 引言P作為一種營養物質在水環境中的重要性很好去理解，近些年，有機磷化合物作為有活性的磷的一種形態，其重要性也引起了人們的關注。有機磷化合物，易被視為是難降解的磷的一部分，而現在已知的其所含有的許多不穩定的種類可能在水體磷的循環中起著重要的作用。在多數水環境中，沉積物在磷循環中起著重要的作用，因為它可以儲存了一大部分從水體沉淀下來的P，無論是暫時的還是長久的。暫時儲存的P最終會被水體吸收。在一些磷輸入量大且易于沉淀的地方，底泥的磷循環可能會大于河流表體。最近一些研究表明，有機磷化合物在水體富營養化中有著很大貢獻，因此，研究控制底泥磷釋放的因素顯得尤為重要。一些關于

2、無機磷化合物的研究已被提出，然而關于特定的有機磷化合物的成巖作用及潛在的遷移性方面的研究卻很缺乏。因此研究影響底泥有機磷遷移運動的因素是非常必要的。然而，這些機制在自然條件下很難監測，一些具體數據通過實驗室的控制實驗來獲取。實驗室研究了不同條件下底泥磷的釋放，可以得知磷的潛在的遷移量，但是無法辨別是哪種形態的P釋放。磷核磁共振波譜（31P NMR）技術可以區分不同種類的有機磷化合物，因此被用來檢測哪種形式的磷在試驗中從底泥中消失或減少了。通過操縱P釋放實驗，我們可以知道對在不同條件下哪種有機磷可以短期或長期存儲在底泥里。利用31P NMR技術，我們可以識別不同磷化合物在不同氧水平下的遷移性，因

3、為氧化還原條件是底泥P遷移運動的主要驅動力，包括內部負荷。另外，我們也對微生物種群進行了調查，因為就像氧化還原條件一樣，微生物活動也很可能很大程度上影響P的運動轉化。這些過程確實是緊密聯系在一起的，例如細菌在還原條件下P的釋放，這個過程在缺氧條件下可能會引起很大部分P釋放出來。此外，細菌通過其所含電子受體接受電子來利用和分解有機質的事實，這說明氧化還原作用起到關鍵作用，也反映了微生物的活性。溫度是影響底泥生物過程的另一個重要參數，底泥負荷隨季節性而變化就可以證明此觀點，這可能是由于隨著溫度的升高，有機質在微生物作用下發生了礦化現象。溫度的升高，除了會影響底泥中有機磷的礦化，同時也會增強無機磷的

4、釋放。我們進行了在不同場景下的模擬實驗，將底泥設置為不同的氧氣水平、不同溫度以及在加入葡萄糖（高活性）或福爾馬林（低活性）下不同微生物活性。這些添加物用來調查微生物種群的影響，尤其是能否區分不同種類的磷是發生了生物降解還是化學降解，因為添加的葡萄糖可以為底泥中微生物提供生長基質，促進磷的生物降解。這樣一方面會使得礦化作用和磷的釋放增加，另一方面會增強P的吸收。如果微生物種群有限，那么將會有較少的P釋放。相反地，在沉積物中添加甲醛是用來終止微生物的活性的，使得化學分解成為主要過程。添加葡萄糖和甲醛同時分別在高和低的氧氣水平下都進行了實驗，以此來研究氧化還原電位對微生物種群的潛在影響。2、 材料與

5、方法 2.1 樣品和實驗地點這項研究中，底泥沉積物來自中度富營養化的Erken湖，在實驗室條件下，用于后續潛在的程巖變化。該湖面積24平方公里，平均水深和最大深度分別是9m和21m，其水體的TP平均濃度是27ug/L。其流域面積137Km2 ,大部分是深林和營養豐富后冰河泥土層。在夏季分層，湖底水體偶爾會變為缺氧狀態。該湖泊已被廣泛研究， Rydin認為該湖已進入一個穩定的營養狀態。使用重錘取樣器（Willner取樣器）在16m水深的50區域里取了12個沉積物樣品。把0-1cm的泥層收集、合并，使其均質化后獲得足夠大的代表性樣品用于實驗。此樣品中干重泥樣的TP濃度為2.0mg/g、含

6、水量93%、有機質含量為200mg/g以及Fe含量為24mg/g。此外，湖底水體pH在7-7.5范圍內變化。 2.2 實驗室裝置上述獲得的沉積物樣品劃分出20個各15g的子樣本，分別裝進沉積室（如圖1）并注入水。不同特征的水被泵以0.3L/d的速率從下方穿過沉積物注入到沉積室里，設置流速緩慢并且使得流量對沉積物的物理影響作用最小，即沒有松動或壓實作用。將沉積物樣品在不同條件下處理，即好氧/缺氧條件、不同溫度條件（4/20）以及加入葡萄糖（1%）/甲醛溶液（3.7%）下的好氧/缺氧條件（20）。溫度的選擇是模擬湖底沉積物表面最高和最低的環境條件。溶氧條件主要通過氧化還原電位的測量，并使用還原劑（

7、亞硫酸鹽）來校正。好氧條件被認為是進水與周圍空氣達到平衡，缺氧則是氧化還原電位低于0mv時。在整個試驗過程中，要確保正確且一致的氧濃度、pH值以及添加劑的濃度，所有方案中pH值均為7。每個樣品處理均設為三個平行樣，除了添加葡萄糖和甲醛溶液外，因為空白控制是重復的。每天一次采集各個子樣本的污水進行磷酸鹽和TP的分析，計算試驗過程中磷的釋放。TP（用1mol HCl于120消解1h）和磷酸鹽含量根據Murphy-Riley法進行分析。試驗進行21天，將沉積物從沉積室腔室中取出提取并進行核磁共振分析。 Fig. 1. Schematic picture of the sediment chamber

8、. 沉積室示意圖 2.3 堿法提取用31P NMR技術分析的所有樣品都要經過預提取，用0.067mol的EDTA（二鈉鹽）處理1h，目的是為了提高提取率。預提取后，經沉淀分離EDTA溶液后在4000 rpm（轉）離心10分鐘，剩余的沉淀物在室溫下用0.1mol的NaOH經16h后提取，NaOH提取液經離心分離。所有的提取物與溶劑配成1:3。在35下經旋轉蒸發把樣品濃縮10倍。濃縮的提取物進行冷凍保存直到進行分析，經驗證明這樣不會影響到提取的磷化合物。采用電感耦合等離子體原子發射光譜法（ICP-AES）測定提取物中的TP。 2.4 核磁共振分析31P NMR技術是使用Varian me

9、rcuryplus核磁共振光譜測定儀在121.5MHz條件下進行測定。測量前向提取物中加入足夠量的 D2O使得其測定時可獲得穩定的信號。光譜記錄使用63個觀察脈沖，獲取時間為0.4s，1.2s的延遲時間，獲取3000左右的瞬變值（12h）。化學變化可間接地參考外部85%的H2PO4(=0.0)的穩定信號。沉積物提取物中加入標準液（Na2HPO4.7H2O正磷酸鹽和Na2P2O7.10H2O焦磷酸鹽）后測定其光譜觀察吸收峰的分布，并與文獻比較（Hupfer etal., 1995, Cade-Menun and Preston, 1996,Makarov etal., 200

10、2 and Turner etal., 2003)。為了獲得峰的面積，原始峰譜信噪比超過4，具有洛倫茲形狀，采用NMR軟件子程序 (Vnmr 6.1C)。從這些峰的地區，個別磷化合物的貢獻計算其相對的P的總提取量。EDTA的預提取不適合做31P NMR技術分析，因為P濃度太低以及高濃度的順磁金屬如Fe、Mn會產生干擾。而我們認為經EDTA提取后結合金屬Fe、Al的主要是無機磷。3、 結果經不同處理的沉積物樣品間，其磷酸鹽和總磷的累積釋放表現出相似的趨勢，磷酸鹽的釋放約為TP的50%。例外的是4處理時的沉積物其P釋放相對較少，釋放的都是磷酸鹽。表1，平均值包括標準差

11、都是基于復制或三份分析，確定的磷化合物組，百分率用斜體表示，以及TP和磷酸鹽的積累釋放。Table.1 圖a.b所示，隨試驗裝置的運行所測得污水中P的總積累釋放量。用20和4分別表示20、4。當沒有出現數字時，溫度為20。Ox和Anox分別被用來表示氧水平好氧狀態和缺氧狀態；用glu和form來表示添加葡萄糖或者甲醛溶液。從圖中可以看出，大多數沉積物樣品的P釋放在試驗終止時也會停止釋放(圖2a和b)。有三種缺氧處理的樣品例外（分別是甲醛、葡萄糖、20的條件），它們在試驗終止時仍然會繼續有P的釋放。這三種處理方法也表現出最高的沉積P的釋放，葡萄糖處理下對應的P的釋放率超過了75%。相比之下，經2

12、0的好氧處理的子樣品其P釋放率只有10%而已。在不同的處理方法下，累積TP的釋放范圍是10-1600ug/g，而累積磷酸鹽釋放范圍是20-700ug/g(圖2b)。總磷和磷酸鹽釋放的相對標準偏差一般在1030%。原始沉積物干重樣品中可提取0.9mg/g的P，可被分為7組：正磷酸鹽 (Ortho-P)、磷酸單酯 (Mono-P)、三組不同的磷酸二酯、DNA-P、磷脂質(P-lipids)（可能的磷壁（酸）質（Teichoic-P），但這也有可能是另外一種磷脂的結果）、焦磷酸鹽 (Pyro-P) 、多磷酸鹽 (Poly-P)。在一些光譜中Pyro-

13、P峰附近會出現額外的峰可能表明Poly-P末端基團的存在。Fig. 3. Typical solution 31P NMR spectra from the various set ups, including the original.在曝光后，在大多數子樣本中均能發現這7組P的成分。添加葡萄糖的缺氧子樣本是個例外，發現其Pyro-P消失了。經甲醛處理過的樣品中，好氧子樣品缺少了Teichioc-P, 磷脂質（P lipids）和DNA-P；而缺氧子樣品缺少磷脂質（P lipids）, DNA-P and 聚磷酸-P（Poly-P）（表1，圖3）。含糖的缺氧子樣品和含甲醛的好氧子樣品，在曝光

14、后，干重中只有500ugP/g。這與兩個好氧子樣品形成了對照，在沒有添加物下，該兩個樣本幾乎沒有釋放磷，初始0.9mg/g的干重P濃度依然被存在。經不同處理后的子樣本中磷化合物的組成由很大差異（表1，圖3）。一般來說，正磷酸鹽 (Ortho-P)和磷酸單酯 (Mono-P)的濃度最高，并且大多數樣品中前者高于后者。與此不同的是，葡萄糖子樣品和20缺氧處理的子樣品中磷酸單酯 (Mono-P)的濃度最高。在不普遍的磷化合物中，聚磷酸-P（Poly-P）在沒有添加物的好氧處理中占優勢， 在其它大多數組中 DNA-P 濃度常常是第三高的。與原

15、始樣相比，聚磷酸-P（Poly-P）濃度一般都會下降，只有4時的好氧處理的聚磷酸-P（Poly-P）濃度保持不變；另外，正磷酸鹽 (Ortho-P)和磷酸單酯 (Mono-P)的濃度是普遍增高的。關于樣品中小成分，與原始樣最大的不同是添加甲醛后的Pyro-P的變化。另一方面，Teichoic-P僅僅發生微小的變化（表1，圖3），除了添加甲醛的好氧處理中該物質的消失。除了添加甲醛的好氧處理的標準偏差較高外，一般情況下，大多數子樣本中不同的磷化合物變化的標準偏差均在10-15%范圍內（表1）。采用GLM（廣義線性模型）在Minitab中對影響結果的因素進行了方差分析(Minit

16、ab inc., State College, PA, USA)。這些研究表明，在所有情況下，除了正磷酸鹽 (Ortho-P)和磷酸單酯 (Mono-P)外，使用添加劑設置的不同的治療方法所確定的磷化合物組之間關于氧化水平有明顯的差異。相比之下，只有聚磷酸-P對溫度的選擇可表現出明顯的差異（表2）。需要注意的是雖然用添加劑作單因素方差分析，但是研究的這兩種添加劑卻對沉積物中有機磷化合物組的構成有著很大影響。表2： 對所確定的化合物根據其對不同實驗設置變量（溫度、氧水平、添加物）的依存關系進行方差分析。星星（1、2或3）表示5%、1%和0.1%的顯著性水平（p值為0.05、0

17、.01、0.001）。結果如下： 為了便于解釋表2中的個別磷化合物組，采用7.6版本的主成分分析（PCA）來進行。PCA使用個別化合物自動定標數據，PC1、PC2分別描述38%和29%的變化（圖4）.為了闡明影響因素對主成分的影響，對個別磷化合物的評分值進行方差分析。根據結果，PC1表述了添加劑（p < 0.001）的影響，PC2主要表述氧水平(p < 0.001)的影響，同時一定程度上也表述了添加劑 (p = 0.006)的影響。在圖4a中沿著PC1，可以發現添加劑分組的情況，往裝置中添加甲醛的在左邊，添加葡萄

18、糖的在右邊，沒有添加物的在中間。相應的差異可以載荷圖（圖4b）中看出，添加甲醛能誘導高濃度的正磷酸鹽 (Ortho-P)和磷酸單酯 (Mono-P)但低濃度的 Lipid-P（磷脂質）, DNA-P 和 Mono-P（磷酸單酯）。雖然氧氣條件對PC2的評分值有很大影響，但由于添加劑的并發影響使得在評分圖（圖4）中沒有明顯的分組現象。Fig. 4.  從沉積物中提取的有機磷組分經不同處理后的主成分分析。圖4a顯示的是PC1和PC2的評分圖，坐標軸表示方差（%），而圖4b表示的是對應的圖4a的負荷。評分圖表示不同處理方式之間的差異性，而負荷圖表示的

19、是對有機磷化物的依存性。4、 討論 4.1 總體來說釋放這項研究表明，特定的有機磷化合物可以反映微生物種群。如當微生物量降低時，磷酸二酯（DNA-P、磷脂質和磷壁酸）都消失了，這表明這些磷化合物的微生物來源。從與原始樣本比較中，就個別的磷化合物組來說，可以看出在各種處理中P的減少主要來自聚磷酸P，先前的研究也可以證實聚磷酸P很容易從沉積物中釋放。這說明在任何的研究條件下沉積物都不會有聚磷酸P的凈產生量。同時，轉而說明沉積物中Poly-P的發現在很大程度上會在水體中殘留，正如對Erken湖的早期研究，也支撐了Hupfer等人對歐洲22個湖泊的研究結論。應該指出的是，處理時的環境參數和在4的好氧處

20、理最相似。這種處理因此在許多方面被認為可作為一個控制處理，關于試驗中有機磷組分的釋放和構成的結論也可能被與原始沉積物樣本和4好氧處理比較。 4.2 氧氣水平相比好氧處理，試驗發現了在缺氧條件下的一個重要結果。缺氧處理會誘發更多的磷釋放，尤其是在添加葡萄糖情況下。我們的研究結果表明 Mortimer（1941）的假設：缺氧條件下內部P的釋放是源自于Fe-P化合物的溶解，這易與因礦化作用的磷釋放混淆。一部分磷酸鹽可能源自聚磷酸-P的礦化，通過分析得到在一些處理中聚磷酸P濃度顯著降低，釋放的磷被證明其組成了磷酸鹽。然而應該注意的是，在用鉬酸鹽分析時，有一部分磷是可能是由于水解產生的。與好氧

21、處理相比，低濃度的活性聚磷酸P和磷脂質在缺氧處理時的表現反映了沉積物在自然缺氧條件下的P的顯著釋放能力。缺氧條件下，由聚磷酸P和磷脂質產生的大量的中間產物如Pyro-P and Mono-P，這很可能表明缺氧條件下降解的程度更高。實驗室特意選擇適當的缺氧條件，是為了確定所有出現的自然條件被覆蓋其中，如夏季可能出現的停滯期（淤塞）。這可能意味著對有機磷化合物的影響比在湖中時的略大，但是其降解和釋放的原則是一樣的。4.3 溫度在低溫處理時，磷酸鹽和總磷都表現出最低的釋放量，這說明這種情境下微生物的活性被限制。這種情況下，雖然核磁共振的結果表明4時微生物的活性很低，但是在 Poly-P&#

22、160;和 Pyro-P之間存在著轉化。除此之外，Pyro-P 似乎也表現出獨立增加性，這就更難以解釋了。比較在4下和20下的處理，可以發現在初始階段溫度越高，就有更多的Poly-P 被去除。這可能是由于較高的礦化率所致，與內部負荷隨季節變化的特點一致，就像 Jensen and Andersen (1992)曾報道的那樣。然而，溫度對P釋放的影響并沒有氧水平對其的影響大，雖然較高溫度下有稍快的釋放（圖2，a和b） 4.3 福爾馬林（甲醛溶液）在添加甲醛的缺氧處理中，磷酸鹽只占總釋放量的20%，這表明沉積物中大量的磷損失了（可能是來自有機磷形式）。這與事

23、實相符，即甲醛殺死微生物導致沉積物中這些形式的P的釋放。因此，在這種處理下，包括無機磷如鐵結合態P在內，還有微生物P都釋放到水體中，如磷酸鹽和生物酶P。然而在所有含添加物的處理都顯示出Poly-P大量減少，只有在那些添加甲醛的處理中顯出出DNAP和磷脂質的缺少。除此之外，在添加甲醛的好氧處理中也表現出除Pyro-P外所測量的所有磷形式都呈下降趨勢，這很有可能反映出Poly-P物在分解過程中的一個中間步驟。這說明了大多數的Poly-P都與微生物量有關，但是就像所有的處理不會有Poly-P的凈產生一樣，這并不影響我們的假設即沉積物中的Poly-P主要來于水體。然而有機磷、Poly-P、Pyro-P的化學分解在某個確定的環境下是顯著的，當然，這并不是說經添加甲醛處理后的所有的改變都是由于純粹的化學過程所致。更可能的場景是，在這些處理中具有活性的Poly-P、DNA-P 和磷脂質的缺少恰恰反映出微生物量的減少，這是由于甲醛具有毒性，而各種細菌也經常含有這些種類的P。當這些細菌死后，它們在這種毒性環境中不會被降解和循環，取而代之的是它們將會隨著水流而被從沉淀室中沖出來。在好氧條件下的磷酸單酯 (Mono-P)的減少，可能反應的是化學分解，因為這類化合物是難以進行快速微生物降解的，如肌醇六磷酸。 4.5 葡萄糖 在添加葡萄糖條件