1、精選優質文檔-傾情為你奉上蛋白質工程及其應用示例摘要：在論述蛋白質工程的基本概念和由來的基礎之上, 介紹了蛋白質工程的主要內容，并著重闡述了蛋白質工程在工業用酶、食品行業和生物制藥三個方面中的應用和前景。關鍵詞：蛋白質工程；簡介；發展與應用；1.蛋白質工程的概念和由來 蛋白質工程是以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎的學科，其主要通過、和的手段進行或，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類對生產和生活的需求。蛋白質工程最早始于1975年美國C. A. Hutehison使用了J. Lederberg 1960年推薦的寡脫氧核糖核普酸作為體外誘變劑，經他重新確定此誘變

2、劑的順序，成功地實現了定位突變試驗，培育出了具有各類生物學特性的突變株1。而蛋白質工程的命名是1981年由美國的K.Ulemer確定的2。繼后，許多大學及著名的實驗室以及經營生物工程高技術產業的公司大量投資競相研究與開發。2.蛋白質工程的基本途徑 從預期的蛋白質功能出發設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到相對應的脫氧核苷酸（基因）3.蛋白質工程的基本原理基因工程通過分離目的基因重組DNA分子，使目的基因更換宿主得以異體表達，從而創造生物新類型，但這只能合成自然界固有的蛋白質。蛋白質工程則是運用基因工程的DNA重組技術，將克隆后的基因編碼序列加以改造，或者人工合成新的基因，再將上述基因通

3、過載體引入適宜的宿主系統內加以表達，從而產生數量幾乎不受限制、有特定性能的“ 突變型” 蛋白質分子，甚至全新的蛋白質分子。4.蛋白質工程的研究內容4.1 蛋白質結構分析 - 基礎蛋白質工程的核心內容之一就是收集大量的蛋白質分子結構的信息，以便建立結構與功能之間關系的數據庫，為蛋白質結構與功能之間關系的理論研究奠定基礎。三維空間結構的測定是驗證蛋白質設計的假設即證明是新結構改變了原有的生物功能的必需手段。晶體學的技術在確定蛋白質結構方面有了很大發展， 但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質(幾毫克幾十毫克)，制備出單晶體，然后再進行繁雜的數據收集、計算和分析。對子哪些很微量的蛋白質來說，是

4、比較困難的。另外，蛋白質的晶體狀態與自然狀態也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。核磁共振技術可以分析液態下的。膚鏈結構，這種方法繞過了結晶、X一射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態下的蛋白質的結構。 現代核磁共振技術已經從一維發展到三維，在計算機的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質的空間結構、蛋白質與輔基和底物結合的情況以及酶催化的動態機理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質的突變。國外有許多研究機構正在致力與研究意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質的突變。國外有許多研究機構正在致力與研究蛋白質與核酸、酶抑制劑與蛋白質的結合情況，以開發具有高度專一性的藥用蛋白質

5、。4.2 蛋白質結構、功能的設計和預測 - 基礎的應用與驗證 根據對天然蛋白質結構與功能分析建立起來的數據庫里的數據，可以預測一定氨基酸序列膚鏈空間結構和生物功能；反之也可以根據特定的生物功能，設計蛋白質的氨基酸序列和空間結構。通過基因重組等實驗可以直接考察分析結構與功能之間的關系；也可以通過分子動力學、分子熱力學等，根據能量最低、同一位置不能同時存在的兩個原子等基本原則分析計算蛋白質分子的立體結構和生物功能。目前，正加緊這方面的工作。雖然尚在起步階段，但在可預見的將來， 建立一套完整的理論來解釋結構與功能之間的關系，用以設計、預測蛋白質的結構和功能。4.3 蛋白質的創造和改造 - 最終目標

6、蛋白質的改造，從簡單的物理、化學法到復雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學法: 對蛋白質進行變性、復性處理，修飾蛋白質鏈官能團，分割膚鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質形成一定的立體構像等等；生物化學法: 使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質，利用轉糖昔酶、酚酶、酸酶等去除或連接不同化學基團，利用轉酞胺酶使蛋白質發生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團或化學鍵發生作用. 缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。采用基因重組技術或人工合成D N A，不但可以改造蛋白質而且可以實現從頭合成全新的蛋白質。蛋白質是由不同氨基酸按一定順序通過肚鍵連接而成的膚構成的。氨基酸序列就是蛋白質的一級結構，它決定著蛋白質

7、的空間結構和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質的氨基酸序列，實現蛋白質的可調控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質功能之間關系之前，宜采用隨機誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代， 這樣就可以將研究目標限定在一定的區域內，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標D N A 明確以后，就可以運用定位突變等技術來進行研究。4.3.1 定位突變蛋白質中的氨基酸是由基因中的三聯密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，研究蛋白質結構、穩定性和催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個階段，在噬菌體粒子中其基

8、因組為單鏈，侵入宿主細胞以后，通過復制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M 13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核昔酸(其中含一個或幾個非配對堿基)作為引物，合成相應的互補鏈，用連接酶連接成閉環雙鏈分子。經轉染大腸桿菌， 雙鏈分子的胞內分別復制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配堿基的就為突變型。再轉入合適的表達系統合成突變型蛋白質。4.3.2 盒式突變1 98 5 年wels提出的一種基因修飾技術 盒式突變，一次可以在一個位點上產生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質分子中重要氨基酸進行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側造成兩個原載體和基因上沒有的內切酶切點，用該內切酶

9、消化基因，再用合成的發生不同變化的雙鏈D N A 片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因3。4.3.3 PCR技術DNA聚合酶鏈式反應是應用最廣泛的基因擴增技術。以研究基因為模板，用人工合成的寡核昔酸(含有一個或幾個非互補的堿基)為引物，直接進行基因擴增反應，就會產生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達系統中合成突變型蛋白質。這種方法直接、快速和高效4。4.3.4 高突變率技術 從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項耗時、費力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率，(1)硫代負鏈法: 核昔酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物( a -( S )-d c T P ) 對

10、某些內切酶有耐性，在有引物和( a -(S )-d c T P ) 存在下合成負鏈，然后用內切酶處理，結果僅在正鏈上產生“缺口”，用核昔酸外切酶l 從3 5 擴大缺口并超過負鏈上錯配的核昔酸，在聚合酶作用下修復正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；(2)UMP正鏈法: 大腸肝菌突變株RZ10 32中缺少脈嗜咤糖昔酸和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脈嗜咤( U )替代胸腺嗜咤( T )摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產生的突變雙鏈轉化正常大腸肝菌，結果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負鏈保留并復制3。4.3.5 蛋白質融合 將編碼一種蛋白質的部分基因移植到另一種蛋白質基因上或將不同蛋白質

11、基因的片段組合在一起。經基因克隆和表達，產生出新的融合蛋白質。這種方法可以將不同蛋白質的特性集中在一種蛋白質上，顯著地改變蛋白質的特性?，F在研究的較多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。5.蛋白質工程的應用示例5.1在工業用酶中的應用5.1.1脂肪酶 脂肪酶能催化酯的水解和合成，廣泛用于洗滌劑的生產，油脂工業，有機合成，皮革及造紙工業。Beer等人5根據酶的X-射線結構建立一模型，并通過定點突變搞清楚了Rhizopus oryzea脂肪酶的催化機制。Okkels等人6通過定點突變使Candida Antarctica A脂肪酶的比活力提高了4倍。Yamaguchi等人7將

12、Cys 二硫鍵引入Humicola lanuginsa 脂肪酶中，突變體的熱穩定性提高了12，酶的最適溫度提高了10。Patka 等人8發現Candida Antarctica B 脂肪酶的M72L突變體抗過氧辛酸氧化作用能力比野生型強。Kampen 等人9研究了Staphylococcus hyicus脂肪酶的突變體對底物專一性的影響，發現把356位的Ser用Val來替換，其磷脂酶活性降低了12倍。Egmond 等人10研究了Fusarium solani pisi 角質酶對陰離子的親和性。發現過N172K突變，酶表面帶有更多的正電荷，同野生型角質酶相比，突變體穩定性更差。在17和196位引

13、入負電荷殘基，則酶對陰離子表面劑活性劑十二烷基磺酸鋰的穩定性提高。Pseudomonas glumae脂肪酶的154和150位的氨基酸殘基用Pro替代，在P1位引入Arg 殘基，酶的抗蛋白穩定性得到了提高。5.1.2纖維素酶 纖維素酶現在已廣泛地應用于醫藥、紡織、日用化工、造紙、食品發酵、工業洗滌、煙草、石油開采、廢水處理及飼料等各個領域，其應用前景十分廣闊。大多數工業用的纖維素酶都是葡萄糖苷內切酶，含有一個催化區和一個纖維素連接區。沒有纖維素連接區則酶對于纖維素的活性很低。現在研究的重點是了解酶的吸附和活性之間的關系。有人對纖維素酶和蛋白酶進行了對照研究，發現纖維素酶的活性與吸附的強弱關系更

14、大11。Koivula 等人12對 Trichoderma reesei的纖維二糖水解酶催化區域169 位的氨基酸殘基Try 進行了研究，發現其能協助葡萄糖環轉換成更容易反應的構形。Hakamada 等人13用定點突變的方法將細菌堿性纖維素酶的Glu137、Asn179和Asp194 突變為Lys，其熱穩定性得到了提高。Zhang 等人14專門研究了T.fusca 纖維素酶Ce16A表面殘基對底物專一性的影響，發覺突變體R237A 對羧甲基纖維素的活力提高了。后來他15又研究了靠近活性位點殘基對催化活性、底物專一性、配基連接親和性的影響，4個殘基（His159、Arg237、 Lys259、G

15、lu263）的7個突變體對羧甲基纖維素的活性都有所提高，其中K259H 突變體的活性提高的最為顯著。5.1.3淀粉酶淀粉酶的使用范圍極廣，種類繁多，根據不同的需要可以選擇不同種類的酶。-淀粉酶主要用來生產麥芽糖糊精，葡萄糖淀粉酶催化糊精可得到葡萄糖，用-淀粉酶可以得到麥芽糖，用葡萄糖異構酶可以將葡萄糖轉化為果糖。而一般的淀粉酶催化都是在高溫條件下進行的。應用蛋白質工程可提高酶的熱穩定性。有人得到B. Licheniformmis -淀粉酶的雙突變體A209V/H133T，酶在90的半衰期延長了9 倍。Mitchinson等人用定點突變和高通量篩選的方法得到了一個突變體，其最適pH 值提高了0.

16、51.0。Gloria等人16用Phe 或Tyr來替換B.stearothermophilus -淀粉酶289 位的Ala，其具有了催化醇化反應的能力。Sierks 等人17報道了通過改變葡萄糖淀粉酶活性位點的三個氨基酸殘基，其作用于1，4-糖苷鍵相對于1，6-糖苷鍵的K cat/Km 比值提高了300倍。5.2在食品工業中的應用5.2.1葡萄糖異構酶的蛋白質工程1992年，Mrabet等人構建了密蘇里游動放線菌葡萄糖異構酶的突變酶K253R，其酶活是野生型的120，在60.lmolL葡萄糖底物存在下。它的熱失活半衰期比野生型酶提高了5倍18。T Jibeurgh等人構建的密蘇里游動放線菌葡萄

17、糖異杓酶的突變酶E185Q明顯改變了酶的最適PH值，而且，與野生酶在Mn2+作用時的活性相比。E185Q要高出兩倍19。另外，美國Amgen公司曾對大腦桿菌葡萄糖異構酶進行了盒式突變，篩選到兩個活性大于野生型的突變酶20。葡萄糖異構酶的蛋白質工程是國家“863”計劃資助項目，中國科學技術大學生命科學學院在這方面做了大量的研究工作，構建了多種性能改善的突變酶21-25，如朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(Glyl38)為目標氨基酸后，用雙引物法對葡萄糖異構酶基因進行體外定點誘變，以脯氨酸(Pr01 38)替代Glyl38，含突變體的重組質粒在太腸桿菌中表達，結果突變型葡萄糖異構酶比野生型的熱失活

18、半衰期延長一倍；最適反應溫度提高1012；酶比活相同26。5.2.2細菌素的蛋白質工程27-32 細菌素是很有潛力的天然食品防腐劑，而細菌素生化和分子水平上的深入研究為細菌素蛋白質工程開辟了新前景。研究表明，即使在三維構象未知的情況下，某些小分子蛋白(如Lantibiotics)或疏水肽的蛋白質工程也是可行的。由于它們的氨基酸殘基數目較少，使得定點突變和隨機突變簡單易行，對其進行一、二級結構水平上的預測及相關小肽的比較分析亦可獲得許多重要的結構信息，有望建立特異性突變方法創造出“嵌臺”細菌素。另外，因其分子量較小，適合于肚二維核磁共振技術研究其二級、三級空間結構及在不同溶劑中的溶液構象。應用蛋

19、自質工程改造細菌素通常有兩類方法，一類是著眼于對細菌素結構與功能關系的深人理解，旨在創造出新的細菌素；另一類是改進現有的細菌素特性以適合于工業生產與應用。未來的細菌素蛋白質工程將主要從以下幾方面著手：提高細菌素產量；改進細菌素溶解性能及在靶位系中的擴散性；提高細菌素的穩定性；拓寬細菌素的抑菌譜；提高細菌素抑菌比活力及研究細菌素的免疫等。在確定出要改造的氨基酸殘基后，還需有合適的系統使突變的細菌素高效表達。5.3在生物制藥中的應用 目前蛋白質工程通過在分子水平上進行設計以及DNA重組對自然界的蛋白質進行突變重新合成，在生物藥物的開發中應用非常廣泛33。蛋白質工程技術對藥物合成做針對性的改造能夠對

20、藥物的穩定性、活性、生物利用度以及半衰期做進一步的優化。在生物藥物的研究開發領域中具有重要的應用價值34?，F主要對定點突變工程技術和體外定向轉化技術在藥物開發中的應用情況做相應的綜述。5.3.1定點突變工程技術定點突變是根據生物醫藥的結構和功能進行針對性的改造，包括活性基團、DNA序列以及特定的核苷酸片段，做特定的插入或者刪除，從而改變生物大分子的氨基酸序列，對藥物的性狀進行改變，在生物藥物的編碼序列以及一級結構中起著很好的修飾作用35。其與自然因素、化學因素誘導的突變相比特異性更強，同時可重復性強。通過改變相應的核苷酸序列對生物醫藥的功能和性質起作用，進而得到具有高活性的改良生物藥物。納豆激

21、酶是一種由納豆枯草桿菌生產的具有溶解纖維蛋白活性的酶，在心血管藥物的開發中具有較高的價值。納豆激酶在實際應用中其穩定性較差，并且極為容易被氧化，對其進行定點突變，在序列中引入絲氨酸和丙氨酸，并改變其相應的催化殘基以及附近的蘇氨酸位點，成功讓其在大腸桿菌中高表達，并且抗氧化測試顯示抗氧化能力明顯增強36。另外還可通過催化抗體從而對免疫球蛋白的活性進行調節，結合相應的突變技術將其催化酶活性進行提高，從而促進相應的酶解反應。采用PCR法進行定點突變也可改變核苷酸序列，結合包涵體對蛋白進行特異性的變性和復性處理能夠純化蛋白質的同時提高其生物活性37。5.3.2體外定向進化技術定點突變技術主要針對天然蛋

22、白的少數位點突變，蛋白質的高級結構沒有顯著變化，同時蛋白質的功能只是部分發生變化。但是對蛋白質的結構和功能做少部分改變并不能滿足人們對蛋白質功能的認知。因此在蛋白質的結構和功能改造中進行體外分子定向轉化有很好的應用價值38。蛋白質工程技術中體外定向轉化也稱作分子進化，通過體外的PCR、DNA技術對蛋白質工程涉及藥物進行高通量篩選后對活性較高的藥物進行篩選，從而得到自然界沒有的品質優良的藥物。其與定點突變不同的是在藥物結構和功能方面不需要已知信息，因此也稱作非理性設計。對于容易錯誤的PCR進行體外擴增時結合適當條件，使得堿基出現誤配等突變，是一種簡單、快速的隨機突變，因此需要結合其他技術進行篩選

23、。通常在一輪定向篩選和選擇后很難得到滿意結果，因此需要對連續突變進行篩選。一次次在錯誤中篩選出相應的有益突變基因，從而在隨機誘變中得到有益累積突變39。例如1，3-丙二醇在醫藥領域中可作為聚酯、聚醚以及聚氨酯的合成單體，在合成過程中相比于采用1，3-丙二醇氧化還原酶，同工酶的活性更高，同工酶是通過突變篩選得到的突變體氧化還原酶，其在很多其他醛類的反應中也有較強的催化活性。另外結合抗原決定簇的化學基團以及環氧化物中間體等對藥物的結構進行調節能夠提升其生物活性。DNA改組是對一些同源但有部分差異的基因序列打碎呈小片段后進行隨機重組，在此過程中利用重疊堿基進行隨機配對后形成重組全長核酸序列，并且結合

24、自然界的模擬對DNA進行重組篩選。DNA重組技術在酶和蛋白藥物的改良和優化中運用較為廣泛，其對酶的活性、穩定性以及特異性都有很好的篩選40。例如丙酮酸的工業和醫藥運用中采用乳酸氧化酶對D，L-乳酸進行氧化制得。為提高其熱穩定性對乳酸氧化酶基因進行改組，得到其突變體，其半衰期和熱穩定性都得到很大的提高。6.結語蛋白質工程匯集了當代分子生物學等學科的一些前沿領域的最新成就, 它把核酸與蛋白質結合、蛋白質空間結構與生物功能結合起來研究。蛋白質工程將蛋白質與酶的研究推進到嶄新的時代, 為蛋白質和酶在工業、農業, 特別是在醫藥方面的應用開拓了誘人的前景。蛋白質工程開創了按照人類意愿改造、創造符合人類需要

25、的蛋白質的新時期。蛋白質本身的多樣性為其多種應用創造了條件, 而隨著蛋白質工程的發展, 在不久的將來又會有一大批人工創造的新蛋白質家族出現。總之, 蛋白質工程對于探索者確是一塊沃土, 在付出必要的勞動之后, 一定會結出豐碩的果。參考文獻：1 Hutehison C、A . 等:J、Biology chemistry1975, 263, 6551.2 U-emer. K .Science1955, 219, 666.3 Wiiliams DF. Mechanisms of biodegradation of implantable polymers. Clinical Materials,199

26、2; (10) : 9 -12.4 Hollingger D. Biodegradable bone repair materials: Clinical orthopedist and related research.1986; 207 : 290-304.5 Beer H D, Wohlfahrt G, McCarthy J E G, et al. Analysis of catalytic mechanism of fungallipase using computer-aided design and structural mutantsJ. Protein Eng. 1996, 9

27、:507-517.6 Okkels J S, Svendsen A, Patkar S A, et al. Protein engineering of microbial lipase ofindustrial interestJ.in: F.X. Malcata (Ed.), Engineering of/with Lipases, NATOASI Series,Series E.Applied Sciences, 1995, 317: 203-207.7 Yamaguchi S, Takeuchi K, Mase T, et al. The consequences of enginee

28、ring an extra disulfidebond in the Penicillium camembertii mono- and diglyceride specific lipaseJ. ProteinEng., 1996,9:789-795.8Patkar S., Vind J., Kelstrup E. et al. Effect of mutations in Candida antarctica B lipaseJ.Chem. Phys. Lipids. 1998, 93: 95-101.9 Kampen M D, Simons J W F A, Dekker N, et a

29、l. The phospholipase activity of Staphylococcus hyicus lipase strongly depends on a single Ser to Val mutationJ .Chem.Phys. Lipids, 1998, 93: 39-45.10 Egmond M R, Vlieg J d, Verheij H M, et al. Strategies and design of mutations in lipasesJ. in:F.X. Malcata (Ed.), Engineering of/with Lipases. Applie

30、d Sciences, 1995,317: 193-202.11 Brode P F, Erwin C R, Rauch D S, et al. Subtilisin BPN variants: increased hydrolyticActivity on surface-bound substrates via decreased surface activityJ. Biochemistry, 1996,36:3162-3169.12 Koivula A, Reinikainen T, Ruohonen L, et al. The active site of Trichoderma r

31、eeseicellobiohydrolase II: the role of tyrosine 169J. Protein Eng., 1996, 9:691-699.13 Hakamada Y, Hatada Y, Ozawa T, et al. Identifation of thermostabilizing residues in aBacillus alkaline cellulase by construction of chimeras from mesophilic and thermostable enzymes and site-directed mutagenesisJ.

32、 Japan FEMS Microbiology Letters, 2001, 195:67-72.14 Zhang S, Wilson D BJ. J. Biochem. 1997, 57: 101-113.15 Zhang S, Barr B K, Wilson D BJ. Eur. J. Biochem. 2000, 267:244-252.16 Gloria S R, Gabriel R, Rosa I, et al. Introducing transglycosylation activity in a liquefying K-amylaseJ. FEBS Letters, 19

33、99, 453: 100-106.17 Sierks M, Svennson B. Protein engineering of the relative specificity of glucoamylase fromAspergillus awamori based on sequence similarities between starch degrading enzymesJ.Protein Eng., 1994, 7: 1479-1484. 18 MraktN TBroeck A V and Van den brande Iet al. Arginine residues as s

34、tabilizing element in proteins. Biochemistry, 1992, 31(8)：2239-225319 Tilbcurgh H V et a1. Biochemistry. 1992, 31: 5167-547l20 Amgen Inc.: US Patent No.4, 894, 331. Ian. 16: 199021崔虹, 州成安和李澄清. 7號淀粉酶鏈霉菌M1033菌株葡萄糖異構醇在太島桿菌中的高效表達，高技術通訊，1993，3(7)：9-12.22 Zhu X Y，Gong W M and Niu L W et al. Crystal struct

35、ure ofSlreptmyces diastaticus No. 7strain M 1033 xylose isomerase. Science in China (series C), 1996, 39(6):636-644.23肖亞中，伍傳金和崔濤木糖異構酶的結構及蛋白盾工程生物工程進展1994,14(3):36-3924肖亞中，伍傳金和龍凡等用蛋白質工程方法改變葡萄糖異構酶最適pH和最適溫度. 生物化學與生物物理學報，1995，27(5)：469-475.25伍傳金，肖亞中和龍凡等K253R和N184v點突變對葡萄糖異構酶熱穩定性的影響生物化學與生物物理學報，1996，28.(3)：

36、272277.26朱國萍滕脈坤和伍傳金等G138P定點突變對葡萄糖異構酶熱穩定性的改善. 生物化學與生物物理學報，199830(6)：607-610.27 Gunnar FOIa RB，Knut Set al .Ncw biologically active Hybrjd bacteriocins constructed by combining regions is important for determining specificity. Appl. Environ. Microbiot.,1996, 62(9): 3313-3318.28 Kulpers OP, Rollema HS,

37、 Yap WM, et al. Engineering dehydrated amino acid residues in the antimicrobial pep tide nisin. Biol Chem, 1992, 267(34): 24340-24346.29 Liu W, Hansan JN. Enhancement of the chemical and antimierobial properties of subtitle by site-directed mutagenesis. J Biol Chem, 1992, 267(35): 25078-25085.30 Han

38、sen JNAntibiotics synthesized by posttransiational modification. Annu Rev Microbiol，1993. 47:535-56431 Kuipcrs OP, Rollema HS, de Vos WM, et al. Blosynhesis and secretion of a precursor of nis in Z by Lactococcus lactic, directed by the leader peptide of the homologous lantibiotic subtitle from Bacillus subtitle. FEBS Lett, 1993, 330(1): 23-27.32 Siezen RJ, Kuipers OP, de Vos