1、轉(zhuǎn)基因材料的檢測轉(zhuǎn)病毒復(fù)制酶基因“華農(nóng)1號”番木瓜的PCR檢測摘要：本試驗接受定性的一次PCR反應(yīng)分析方法，依據(jù)供應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物材料中轉(zhuǎn)入基因，啟動子，終止子和基因本身的DNA序列，設(shè)計出四對特異的PCR擴(kuò)增引物35S-F與35S-R、NPT1-F與NPT1-R、HN1F與HN1R、HN2F與HN2R，兩對非特異性的PCR擴(kuò)增引物Nos2-F與Nos2-R 、HN3F與HN3R，然后以華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜、野生型木瓜、待測樣品的DNA為模板，為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示野生型木瓜都沒有擴(kuò)增出條帶，轉(zhuǎn)基因木瓜都擴(kuò)增出條帶，待測樣品除了NPT1-F與NPT1-R沒有擴(kuò)增出條帶，其他都有，可以確

2、定待測樣品為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；PCR定性檢測；轉(zhuǎn)病毒復(fù)制酶基因；華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因作物從1996年在全球開頭進(jìn)入商品化生產(chǎn)，經(jīng)過12年的進(jìn)展,其種植的面積從當(dāng)年的170萬hm2擴(kuò)大到2007年的1.14億hm2 1，為愛護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，多個國家和地區(qū)強(qiáng)制要求對含有肯定閾值以上轉(zhuǎn)基因成分的產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識，如歐盟規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分含量標(biāo)識的閾值是0.9%2，韓國為3.0%3,日本是5%4等，而美國和加拿大則接受了推舉而非強(qiáng)制的標(biāo)識制度。我國也從2002年3月開頭,要求對大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5種作物的17種產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識5，為了適應(yīng)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識要求，已經(jīng)建立了一系列的檢測方法

3、，以基于其中外源DNA檢測的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR應(yīng)用最廣泛6。轉(zhuǎn)基因材料的檢測主要是針對選擇性標(biāo)記和報告基因、轉(zhuǎn)入基因、啟動子和終止子等方面的檢測，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的重要手段。如椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子、胭脂堿合酶NOS終止子等10多種基因和基因片段廣泛存在于轉(zhuǎn)基因植物中，這就為檢測轉(zhuǎn)基因材料/食品供應(yīng)了便利。核酸水平的檢測可以分為定性和定量兩種。早在20世紀(jì)初科學(xué)家就發(fā)覺了病毒具有交互愛護(hù)作用，近年來，科研工作者也利用這一原理開展了大量的轉(zhuǎn)病毒部分基因組的轉(zhuǎn)基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的進(jìn)展。抗病毒基因多數(shù)來自于病毒本身的基因，病毒的外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因、運(yùn)動蛋白

4、基因等，并已經(jīng)在番木瓜上獲得成功轉(zhuǎn)化7。本試驗依據(jù)供應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物材料中轉(zhuǎn)入基因，啟動子，終止子和基因本身的DNA序列，設(shè)計出幾個適用于檢測轉(zhuǎn)基因材料的引物對，然后以野生型番木瓜和轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)1號”以及待測樣品DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒別待測樣品是否為轉(zhuǎn)基因材料。1 材料與方法1.1 材料華農(nóng)1號野生型木瓜待檢測樣品1.2 方法 1.2.1 DNA提取 1.2.1.1 稱取0.5 g的植物葉片，擱置于研缽中，加入液氮，搗碎葉片。1.2.1.2 加入650 l預(yù)熱的DNA提取緩沖液，用力振蕩1-2分鐘，放入65水浴鍋保溫45分鐘以上，其

5、間，每隔15分鐘用手稍微振蕩3-4次。1.2.1.3 從水浴鍋中取出樣品管，加入650 l預(yù)冷的24:1的氯仿:異戊醇，蓋好管蓋后緩慢上下顛倒搖動5-10分鐘。1.2.1.4 10,000 rpm下離心10分鐘。1.2.1.5 用移液槍緩慢吸取上清液約500-700 l至一個新的1.5 ml離心管中。1.2.1.6 上清液中加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，約330-470 l。輕輕上下?lián)u動離心管，留意觀看DNA將從溶液中析出。1.2.1.7 在8000 rpm條件下離心5分鐘。1.2.1.8 倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底。1.2.1.9 加入70%乙醇600 l洗滌沉淀，5000 rpm條件下

6、離心去上清液。再重復(fù)洗滌沉淀一次。1.2.1.10 室溫下干燥DNA沉淀，在見到無色膠狀物附在管壁時，加入80-100l無菌蒸餾水溶解沉淀的DNA。1.2.1.11 用分光光度計檢測所提取DNA的質(zhì)量和濃度。1.2.2 PCR反應(yīng) 1.2.2.1 按表1加入PCR各反應(yīng)成分于0.2ml的PCR反應(yīng)管中。表1：PCR反應(yīng)MASTER MIX成分試劑1 Mix4 Mix體積（l）體積（l）10×PCR buffer1425 mM MgCl2_5 mM dNTPs mixture0.41.610 nmol Primer 11410 nmol Prim

7、er 21420-100 ng/ul Template DNA2_Taq DNA polymerase0.10.4ddH2O4.518Total10321.2.2.2 混勻表1的反應(yīng)液后，然后分裝到3個標(biāo)記轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因、待測的PCR管，每管10 l，分別再加入對應(yīng)的DNA 2 l，然后稍作離心，進(jìn)行PCR。1.2.2.3 將反應(yīng)管置于PCR儀中，按表2的反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增表2 PCR反應(yīng)的變溫程序階段循環(huán)次數(shù)溫度持續(xù)時間11945min2359445s5445s721min31727min44 保溫1.2.2.4 制備1.5%的瓊脂糖凝膠 1.2.2.5 反應(yīng)結(jié)束后

8、，在反應(yīng)產(chǎn)物加入2ul 6×Loading Buffer，用微量移液槍當(dāng)心加入樣品槽中，留意上樣時要當(dāng)心操作，避開損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。1.2.2.6 加完樣后，合上電泳槽蓋馬上接通電源，進(jìn)行電泳，100 V，20 min。電泳結(jié)束后，紫外觀看并拍照。1.3 PCR定性分析的引物表3 PCR定性分析的引物（本試驗使用的是1,3,4,6,7,8號引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增8-9）基因名稱編號引物名稱引物序列 5-3產(chǎn)物大小CaMV35s啟動子135S-FGCTCCTACAAATGCCATCA195 bp，邵碧英等,2002;阮小蕾等,201035S-RGATAGTGGGATTGTGC

9、GTCANos啟動子/終止子2Nos1-FATCGTTCAAACATTTGGCA165 bpNos1-RATTGCGGGACTCTAATCATA3Nos2-FGAATCCTGTTGCCGGTCTTG阮小蕾等,2010Nos2-RTTATCCTAGTTTGCGCGCTANPT II基因4NPT1-FAGGCTATTCGGCTATGACTGG600 bp，邵碧英等,2002NPT1-RGCGGTCCGCCACACCCAGCCG5NPT2-FATGATTGAACAAGATGGATTGNPT2-RTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGRP基因6HN1FGCTGAGTGGCTCCTTCAACGT75

10、3 bpHN1RCGACAAGTTGAGTTCGTGGGA7HN2FTGACTCCCTTAATTCTCCGCT298 bp，姜大剛等,2009HN2RTGACGAGTACAAGGAGACGCC8HN3FGTGGTTCATGTCACATCGAG150 bp,阮小蕾等,2010HN3RAATACACCAGTAGCTCAGGC9HN4FATTGACGAGTACAAGGAGACGC285 bpHN4RCTCCGCTCATGATCAGATTGT2 結(jié)果與分析2.1結(jié)果 由圖1可看出，使用引物35S-F與35S-R、NPT1-F與NPT1-R、HN1F與HN1R、HN2F與HN2R、Nos2-F與Nos2

11、-R 、HN3F與HN3R（即引物對1,4,6,7,3,8）這六對引物組合進(jìn)行華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜、野生型木瓜及待測樣品DNA的PCR擴(kuò)增，作為陽性對比的轉(zhuǎn)基因木瓜都擴(kuò)增出條帶，作為陰性對比的野生型木瓜都沒有擴(kuò)增出條帶，而待測樣品在只有4號引物沒有擴(kuò)增出條帶。而我小組華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜與待測樣品DNA都擴(kuò)增出條帶，野生型木瓜沒有擴(kuò)增出條帶，且華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜擴(kuò)增的條帶較待測樣品亮，而不同的引物之間擴(kuò)增的片段堿基對數(shù)有所不同。圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖（從右往左，每對引物對應(yīng)的三個DNA樣分別是華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜、野生型木瓜、待測樣品）2.2分析試驗結(jié)果顯示，作為陰性對比的野生型木瓜都沒擴(kuò)增出條帶，

12、作為陽性對比的華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜都擴(kuò)增出條帶，這與理論相符，野生型木瓜不含這些CaMV35s啟動子，Nos啟動子/終止子等基因片段故不能擴(kuò)增出相應(yīng)的任何片段，而轉(zhuǎn)基因木瓜含這些基因。且待測樣品擴(kuò)增出的條帶與華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜相對應(yīng)的條帶片段大小基本全都，說明本試驗的待測樣品為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。就待測樣品而言，4號引物能特異性擴(kuò)增待測樣片段，而試驗結(jié)果顯示沒有條帶，可能試驗操作的失誤。我小組的試驗結(jié)果表示試驗成功，而華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜擴(kuò)增的條帶較待測樣品亮，說明8引物擴(kuò)增出的華農(nóng)1號轉(zhuǎn)基因木瓜的量比較多。而不同的引物之間擴(kuò)增的片段堿基對數(shù)有所不同，這是特異性引物之間的片段長短不同，故擴(kuò)增的片段大小不一

13、。3. 爭辯本試驗對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測是接受的通用元件篩選PCR檢測，而通用元件篩選PCR檢測主要以轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的通用元件和標(biāo)記基由于特異性擴(kuò)增片段，例如 CaMV35S 啟動子、 FMV35S 啟動子、 NOS 終止子、 7S 3 終止子等通用元件以及 NptII 、 Hpt 、 Pat 、 GUS 、 aad 等標(biāo)記基因。由于相同的通用元件和標(biāo)記基因經(jīng)常被用于多種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的爭辯與生產(chǎn)中，從而大大降低了篩選

14、PCR檢測的特異性，只能用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的初步篩選。因此可以通過基因特異性 PCR(Gene-specific PCR) 檢測、構(gòu)建特異性 PCR(Construct-specific PCR) 檢測、品系特異性 PCR(Event-specific PCR) 檢測等方式來提高篩選PCR檢測的特異性。另外，也可以通過基于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品來對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測，例如酶聯(lián)免疫吸附法、側(cè)向流淌免疫測定法等。通過本試驗，我學(xué)會了比較簡潔的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測，同時也對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行深化了解。而且通過近三周的分子試

15、驗把握了比較基本的分子試驗。盡管試驗有失敗（逆轉(zhuǎn)錄PCR四只管只有一只擴(kuò)增出條帶),但是我生疏到對待科學(xué)試驗要持嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，不能草率了事。最終，感謝老師在試驗過程賜予我的指導(dǎo)及同學(xué)的掛念。 參考文獻(xiàn)1James C. Global status of commercialized biotech/GM crops 2007. ISAAA breif No 37. Executive summanyM. New York International Service for the equisition of A gribiotech Applications (ISAAA). 2007.2Eur

16、opean Commission Regulation(EC)No.1829, 2003 and1830, 2003J. Off Eur Commun L,2003,18(268):1-28.3Notification No. 2000-31 Ministry of Agriculture and Forestry of Korea, Seoul, Korea.2000,22Z.4Notification No.1775 Food and Marketing Bureau,Ministryof Agriculture,Forestry and Fisheries of Japan,Tokyo,Japan,2000Z.5中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理方法Z.(2002).6Ahmed F E. Detection of genetically modified organisms in foodsJ. Trends Biote