1、    抗角蛋白自身抗體對(duì)家兔接觸性皮炎的影響        作為天然自身抗體(natural autoantibody,NAA)家族的一員，抗角蛋白自身抗體（antikeratin autoantibody, AK auto Ab ）廣泛存在于人和多種動(dòng)物體內(nèi)。現(xiàn)已明確NAA具有參與機(jī)體對(duì)外來(lái)?yè)p傷的非特異性防御、加速代謝產(chǎn)物的清除、抗炎等作用1。眾多學(xué)者在對(duì) AK auto Ab 的研究中證實(shí)，其參與了機(jī)體和皮膚的多種生理和病理過(guò)程，對(duì)于維持表皮的自身穩(wěn)定具有重要意義2。為

2、了直接觀察 AK auto Ab 對(duì)皮膚病理狀態(tài)的影響，明確其在體內(nèi)的作用，并使 AK auto Ab 的應(yīng)用向臨床過(guò)渡，我們對(duì)照觀察了人 AK auto Ab 對(duì)家兔刺激性接觸性皮炎的影響。一、材料和方法(一)試劑準(zhǔn)備：按李承新等3的方法制備 AK auto Ab ，并應(yīng)用鹽析法從親和純化 AK auto Ab 后的混合正常人血清中提取丙種球蛋白。(二)動(dòng)物處理：取36只成年雄性新西蘭白兔（體重1.52.5kg；本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），按文獻(xiàn)4用硫化鈉溶液誘發(fā)刺激性接觸性皮炎。隨機(jī)將動(dòng)物分為3組，每組12只，分別對(duì)應(yīng)于 AK auto Ab 組、去除 AK auto Ab 的丙種球蛋白對(duì)照組

3、(以下簡(jiǎn)稱丙種球蛋白組)及空白對(duì)照組。肌內(nèi)注射給藥， AK auto Ab 組和丙種球蛋白組劑量為5mg/kg，空白對(duì)照組給予生理鹽水注射。每天給藥1次，連續(xù)給藥12d。硫化鈉作用前24h取家兔正常皮膚標(biāo)本及耳靜脈血，作用后8h、第3、7、12天取皮損及對(duì)側(cè)正常皮膚標(biāo)本和耳靜脈血。采用盲法，具體操作者不知實(shí)驗(yàn)分組情況。(三)皮膚反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參照有關(guān)文獻(xiàn)制定皮膚反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)5,6。紅斑：無(wú)反應(yīng)為0，散在紅點(diǎn)為0.5，非連續(xù)紅斑為1.0，連續(xù)紅斑為2.0，中度紅斑為3.0，重度紅斑為4.0。腫脹：無(wú)反應(yīng)為0，輕度水腫為2.0，中度水腫為3.0，重度水腫為4.0。糜爛：無(wú)反應(yīng)為0，輕度糜爛

4、為4.0，中度糜爛為5.0，重度糜爛或潰瘍?yōu)?.0。由3位未參與實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行評(píng)分，取其平均值。(四)HE染色及有核細(xì)胞計(jì)數(shù)：冰凍切片，HE染色。高倍鏡下每個(gè)標(biāo)本在真皮淺層隨機(jī)選5個(gè)視野，對(duì)真皮附屬器以外的有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，以進(jìn)行有核細(xì)胞密度定量檢測(cè)7。每張切片均由3人觀察及評(píng)分，取其平均值。(五)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：以本室制備人角蛋白為抗原,2BSA372h,倍比稀釋血清4過(guò)夜,羊抗人IgGHRP(華美公司)371h,OPD顯色，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)492nm吸光值3。(六)S Ab C染色7：冰凍切片，冷丙酮固定30min，0.3H2O2甲醇溶液室溫20min，2BSA371h,14000生物素標(biāo)兔抗人Ig

5、G抗體(Pierce公司)4過(guò)夜，S Ab C復(fù)合物(博士德公司)3730min，D Ab 顯色。二、結(jié)果(一)大體觀察：飽和硫化鈉溶液作用于家兔皮膚立刻引起局部紅斑、腫脹及少許糜爛，各組間反應(yīng)較均勻一致；炎癥于12d內(nèi)達(dá)到高峰，之后炎癥反應(yīng)減弱，修復(fù)增強(qiáng)。各組皮膚反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。第1、3天各組間差異無(wú)顯著性，第5天 AK auto Ab 組與空白對(duì)照組比較差異有顯著性，第712天 AK auto Ab 組與兩個(gè)對(duì)照組比較差異均有顯著性。提示 AK auto Ab 組炎癥消退速度明顯快于兩對(duì)照組，皮膚損傷修復(fù)快、愈合好。兩對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(統(tǒng)計(jì)結(jié)果未顯示)。(二)HE染色：

6、硫化鈉作用后8h，皮損表皮可見(jiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)水腫，細(xì)胞間水腫較輕；真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。炎癥反應(yīng)在3d以后開(kāi)始減弱。以真皮淺層有核細(xì)胞記數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)皮膚炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。各組細(xì)胞數(shù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。第1、3天各組間差異無(wú)顯著性，第7、12天 AK auto Ab 組與兩對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異。提示 AK auto Ab 組炎癥反應(yīng)消退速度明顯快于兩對(duì)照組。兩對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(統(tǒng)計(jì)結(jié)果未顯示)。此外，丙種球蛋白組與空白對(duì)照組皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增生，真皮成纖維細(xì)胞、膠原增生明顯強(qiáng)于 AK auto Ab 組。(三)ELISA： AK auto Ab 組動(dòng)物血清中可檢測(cè)到人 AK

7、auto Ab 存在，滴度為132164。丙種球蛋白組及空白對(duì)照組動(dòng)物血清中未檢測(cè)到人 AK auto Ab 。 組別第1天第3天第5天第7天第9天第12天AK auto Ab 組17.83±1.3415.25±1.8212.92±1.519.83±1.646.55±1.513.18±1.17丙種球蛋白組17.42±1.1615.92±1.8314.17±1.7513.75±1.5411.42±1.319.33±1.49空白對(duì)照組17.67±1.3016.55

8、77;1.3715.00±1.0014.36±1.2112.27±1.2710.27±1.74t1值0.800.901.876.048.2810.94P1值>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01t2值0.301.923.867.659.6113.62P2值>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01注： AK auto Ab 組與丙種球蛋白組比較結(jié)果為t1、P1，與空白對(duì)照組的比較結(jié)果為t2、P2組別第1天第3天第7天第12天AK auto Ab

9、 組378.7±78.3355.1±63.3167.0±44.647.18±23.7丙種球蛋白組353.7±64.2340.3±50.8288.5±45.9154.0±21.3空白對(duì)照組355.7±69.5350.1±51.3306.9±30.6172.9±16.4t1值0.850.636.5511.38P1值>0.05>0.05<0.01<0.01t2值0.760.5011.7814.47P2值>0.05>0.05<0.01<

10、0.01注： AK auto Ab 組與丙種球蛋白組比較結(jié)果為t1、P1，與空白對(duì)照組的比較結(jié)果為t2、P2(四)S Ab C：給藥第7天以后 AK auto Ab 組動(dòng)物皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)染色，空白對(duì)照組和丙種球蛋白組未見(jiàn)染色，對(duì)側(cè)正常皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)亦未見(jiàn)染色，提示 AK auto Ab 組動(dòng)物皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿中有人 AK auto Ab 沉積。三、討論本實(shí)驗(yàn)肉眼及光鏡觀察均顯示 AK auto Ab 組動(dòng)物皮膚炎癥消退迅速，皮膚損傷修復(fù)快、愈合好，與對(duì)照組差異有顯著性，而兩對(duì)照組間差異無(wú)顯著性。ELISA結(jié)果顯示 AK auto Ab 組動(dòng)物血清中人 AK au

11、to Ab 持續(xù)存在。S Ab C染色顯示動(dòng)物表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)人 AK auto Ab 的沉積。以上結(jié)果提示人 AK auto Ab 參與了動(dòng)物皮膚損傷的炎癥及修復(fù)過(guò)程，并可能發(fā)揮了積極的作用。本實(shí)驗(yàn)采用去除 AK auto Ab 的丙種球蛋白作為對(duì)照，排除了 AK auto Ab 作為免疫球蛋白的非特異性作用。本文結(jié)果還顯示人 AK auto Ab 具有同動(dòng)物本身 AK auto Ab 相似的作用，進(jìn)一步表明 AK auto Ab 積極參與了皮膚炎癥反應(yīng)，并可能起到了促進(jìn)作用。同時(shí)提示不同種屬間 AK auto Ab 可能具有較高的同源性和相似的生物學(xué)作用。國(guó)家新藥研究與產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)項(xiàng)目資助

12、課題作者單位：李巍（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）李冰（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）劉玉峰（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）趙小東（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）李承新（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）黃慧（710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）參考文獻(xiàn)1 Lacroix? Desmazes S, Kaveri SV, Mouthon L,et al. Self? reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. J Im

13、munol Methods, 1998,216:117 137. 2 Liu YF, Liu YF, Zhang TS, et al. Immunohistochemical study of anti keratin autoantibodies in both normal and pathological state. Chin Med J, 1993,106:393 395. 5 Arlette JP, Fritzler MJ. Reduced skin threshold to irritation in the presence of allergic contact dermatitis in the gu