1、    心肌梗塞與細胞凋亡關系的初步探索        摘要探索人類心肌梗塞時心肌細胞凋亡的證據。選用TUNEL的方法對22例急慢性心肌梗塞的心肌標本及14例無心血管疾病的心肌標本進行檢測。應用免疫組化的方法對細胞凋亡的相關基因Bcl-2和Bax進行檢測。急性梗塞區及梗塞周邊區凋亡細胞明顯增多，以周邊區域最為明顯(P0.001);陳舊梗塞區仍能見到凋亡細胞，較急性區域明顯減少(P0.001)；在梗塞組正常區域及對照組偶見有凋亡細胞，2組間無顯著差異。在人類心肌梗塞的細胞學檢測

2、中發現有大量的凋亡細胞，為認識心血管疾病展示了新的視野。關鍵詞心肌梗塞細胞凋亡Bcl-2Bax 細胞凋亡(Apoptosis)是一種與壞死截然不同的死亡方式，這是一種經基因精密調控的程序化細胞死亡(Programmed cell death)1。以往的研究認為細胞凋亡不發生在終末分化的心肌細胞和神經元細胞中。直到90年代初，由于凋亡的分子生物學方面的進展及實驗手段的提高，人們在多種心血管疾病及正常老年心臟中發現了細胞凋亡的證據2，3，并開展了心肌細胞凋亡及相關基因的研究，但目前國內在此方面的報道較少。為此，我們將我院1986年至1997年36例尸檢標本進行回顧性研究，以探索人類心肌梗塞與心肌細

3、胞凋亡的關系，對人類最終控制心血管疾病提供理論依據和防治措施。材料和方法1.資料來源36例心肌標本取自同仁醫院1986年至1997年尸檢標本。急性心肌梗塞病人22例，其中10例伴有陳舊心梗。臨床上均有急慢性心肌梗塞病史，組織學有急慢性心肌梗塞的病理改變。對照組14例是臨床無心血管疾病依據，(死于消化道出血，車禍，中毒性肺炎等)，病理無心肌缺血表現的心肌標本。2.方法凋亡細胞檢測選用末端標記TUNEL法，TUNEL試劑盒購自美國Boehringer Mannheim公司，具體按照試劑盒內說明書操作，以Tris-HCL緩沖液替代生物素標記末端轉移酶的切片同時染色作為陰性對照。Bcl-2和Bax檢測

4、應用生物素-鏈酶親和標記蛋白顯色法，Bax兔IgG多抗，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體，生物素化山羊抗兔(IgF-Bio)二抗及辣根酶標記鏈霉卵白素(S-A/HRP)等試劑購自美國Zymed公司。具體操作如下：切片脫蠟至水，3% H2O2浸泡15min，滴加5%的正常大鼠血清封閉10min，吸干血清，滴加一抗，4過夜，辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素孵育60min，DAB顯色，蘇木素復染。以Tris-HCL緩沖液替代一抗的切片同時染色作為陰性對照。所有標本同時切片行常規HE染色。3.評定方法TUNEL染色，陽性細胞核為棕黃色；Bcl-2和Bax染色，陽性細胞漿為棕黃色。選取相應部位，細胞計數在200

5、倍高倍視野下，用標準的10×10目鏡欄珊計數，共計數10個視野；結果以陽性細胞數占細胞總數的平均百分比表示。4.統計分析本研究所有數據均用SPSS軟件進行統計學處理。數據以均數±標準差表示，組間差異比較采用t檢驗。結果1. HE染色(1)急性梗塞區域早期損傷的心肌仍保存細胞輪廓，細胞核固縮，肌漿凝聚；胞漿嗜酸性增強，橫紋不清或消失收縮帶形成；進一步發生凝固性壞死。凝固性壞死的心肌細胞位于梗塞中心區，梗塞間質有出血和炎性細胞浸潤(1)。(2)陳舊梗塞區心肌纖維消失代之以瘢痕組織形成(2)。(3)對照組觀察左心室，均為正常的組織學形態，無出血壞死和炎癥表現。所有標本未見有典型凋

6、亡小體。1急性心梗組織胞漿嗜酸性增強，可見凝固性壞死及炎性細胞浸潤HE×1002陳舊心梗組織可見局部瘢痕形成HE×1002.TUNEL染色(1)與HE相對應的急性梗塞區梗塞周邊區均有較多細胞核呈棕色凋亡細胞，較對照組明顯增多(P0.001)，以周邊部增多最為顯著，與梗塞中心區相比P0.001。(2)陳舊梗塞區可見有散在的凋亡細胞，較急性區域明顯減少(P0.001)。(3)遠離梗塞區及對照組的心肌組織中極偶見凋亡細胞。對照組的凋亡細胞數量與遠離梗塞灶的正常區域的心肌組織無差異(P=0.698)見37，表1。表1凋亡細胞在心梗各區域及對照組中的分布急性梗塞區A急性周邊區B陳舊梗

7、塞區C梗塞組正常區D對照組E均數標準差標準誤19.377.941.6936.2714.443.084.721.820.673.521.990.423.222.150.833急性心梗組織可見較多凋亡細胞 TUNEL染色×2004陳舊心梗組織凋亡細胞散在分布 TUNEL染色×2005Bcl-2陽性細胞呈散在分布 Bcl-2染色×1006Bax陽性細胞呈散在分布 Bax染色×1007凋亡細胞在各組分布3.Bcl-2和Bax染色(1)急性梗塞區及周邊區域Bcl-2表達增加(20/22)；Bax的表達亦增加(21/22)(5)。(2)陳舊梗塞區域Bcl-2偶見(1

8、/10)，而瘢痕區未見Bcl-2的表達；陳舊梗塞區域仍可見Bax有較多表達(6)。(3)正常對照組及梗塞組正常區域極偶見Bcl-2的表達；Bax的表達較前2組減少。表2Bcl-2和Bax在心梗各組及對照組中的分布急性梗塞區陳舊梗塞區梗塞組正常區對照組Bcl-2表達Bax表達91.1%(20/22)95.4%(21/22)20.0%(2/10)33.3%(3/10)9.1%(2/22)13.6%(3/22)7.0%(1/14)21.1%(3/14)討論程序化細胞死亡-細胞凋亡存在于各組織細胞中，對細胞的正常分化，成熟和發育具有重要的平衡意義。然而，細胞凋亡異常又會帶來嚴重危害。在終末期分化的心肌

9、細胞中，細胞凋亡的研究起步較晚。1993年，人們在ARVD(先天右室發育不良)的病人心肌上發現了細胞凋亡的證據4，它提示在人類心臟上亦存在有細胞凋亡。Saraste等5用TUNEL和瓊脂糖免疫凝膠電泳的方法對8例死于急性心肌梗塞的病人心肌標本進行研究，其中6例是生前接受了成功溶栓的組織標本，結果顯示各標本均可見到典型的凋亡生化特征。心肌細胞凋亡在心肌梗塞的周邊部(border zones)最為明顯。本實驗與Saraste等結果相一致，在急性心梗時，在急性梗塞中心部及其周邊部可檢測到較多凋亡細胞，以梗塞周邊部最為顯著，在陳舊梗塞區域仍能見到凋亡細胞。推測在心肌細胞發生缺血損傷時首先啟動了凋亡機制

10、，隨著損傷加重和時間的延長，缺血中心區域便出現壞死，而梗塞周邊的心肌細胞處于可逆的損傷狀態，在這一區域的細胞死亡仍以凋亡為主。一些實驗顯示心室壁重構現象，存活的心肌細胞肥大及毛細血管增生減少在鄰近梗塞區域更為明顯6，提示心肌細胞凋亡使心梗后結構和功能的恢復受到限制。周邊部心肌細胞凋亡使梗塞周圍的心肌細胞繼續死亡。可見心肌細胞凋亡在心梗預后中起著重要的作用。另外，在陳舊梗塞區域見到細胞凋亡，證實細胞凋亡可長期存在于梗塞周邊部，在較長時間內可因細胞凋亡使心肌細胞丟失。本實驗中未發現有凋亡小體，可能存在下列原因：1.細胞凋亡后凋亡小體迅速被巨噬細胞吞噬，這種過程較短暫，不易被觀察到。2.由于鄰近壞死

11、細胞激活了炎性細胞而改變了細胞凋亡的進程。炎性細胞的浸潤和激活可能使凋亡轉化為壞死，即凋亡和壞死可能有共同途徑。3.可能在心肌細胞中只要部分凋亡途徑被激活。染色質固縮和DNA片段化可在心肌組織中觀察到7，而形成凋亡小體的必要因素在心肌組織中缺失。但要發現凋亡小體缺失的確切原因，需進行系統細致的研究。原癌基因Bcl-2是目前公認的促進細胞生存抑制細胞凋亡的長壽基因8。正常情況下，Bcl-2在心肌中不表達，Bax僅有弱表達。在本實驗中在急性梗塞區域可見有Bcl-2表達增加，而陳舊梗塞區僅有弱表達。推測Bcl-2的表達挽救了心梗早期階段的存活細胞。在心肌細胞受到缺血損傷時，Bcl-2立即啟動，其基因

12、產物的表達可抑制或逆轉細胞凋亡的發生，與此同時Bax與Bcl-2平行增高，Bcl-2和Bax的相互作用決定了細胞是否繼續存活9。Bcl-2抑制細胞凋亡的機制尚不十分清楚，可能與抗氧化途徑，阻止細胞內鈣重新分布，直接或間接影響其他死亡信號對細胞的作用，以及加速DNA的修復來起作用。Bax是與Bcl-2同處一家族的成員之一，可通過與Bcl-2形成異源二聚體，從而抑制了Bcl-2的作用。目前心血管疾病已成為威脅人類生命的重要病因，心肌梗塞的發病率亦呈上升趨勢。在人類急性心肌梗塞中細胞凋亡及其標志物的發現拓展了心肌梗塞的發病機理。細胞凋亡是一個復雜的過程，是有動態發展的特點，如能尋求控制心肌細胞凋亡的

13、機制，對心臟病患者的診斷及治療有重要意義。劉琦(首都醫科大學附屬北京同仁醫院干部醫療科100730)常志文(首都醫科大學附屬北京同仁醫院干部醫療科100730)參考文獻1，Kerr,JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239257.2，Richardo HB,Hailey LS,Xie SS,et al.In situ apoptosis assay for the

14、 detection of early acute myocardial infarction.American J of Pathol,1996,149:821829.3，Narula J,Haider N,Virmani R,et al.Apoptosis in cardiomcytes in end-stage heart failure.N Engl J Med,1996,335:11811189.4，Mallat Z,Tedgui A,Fontaliran F,et al.Evidence of apoptosis in arrhythmogenic right ventricula

15、r dysplasia.The New England Journal of Medicine,1996,335(16):11901201.5，Saraste A,Pulkki K,Kallagoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation,1997,95:320323.6，Anversa P,Oliveiti G,Meggs LG,et al.Cardiac anatomy and ventricular loading after myocardial infaract.Circulation,1

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