1、人細胞角蛋白17(CK-17酶聯免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供體外研究使用預期應用ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中CK-17含量。實驗原理用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗CK-17抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗CK-17抗體、HRP標記的親和素,經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CK-17呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值,計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯板:一塊(96孔2.標準品(凍干品:2瓶,每瓶臨用前以

2、樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20ng/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋20ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml, 1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0ng/ml,臨用前15分鐘內配制。如配制10ng/ml標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml20ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。3.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。4.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。5.檢測稀釋液B:1&#

3、215;10ml/瓶。6.檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔,實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A 的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制。7.檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8.底物溶液:1×10ml/瓶。9.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。10.終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4。標本的采

4、集及保存1.血清:全血標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20或-80保存,但應避免反復凍融。2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2-8°C1000x g離心15分鐘,或將標本放于-20或-80保存,但應避免反復凍融。3.細胞培養物上清或其它生物標本:請1000x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20或-80保存,但應避免反復凍融。注:以上標本置4保存應小于1周,-20或-80均應密封保存,-20不應超過1個月,-80不應超過2個月;標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測

5、;高血脂的標本不需進行特殊處理,可直接檢測。操作步驟實驗開始前,請提前配制好所有試劑;試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,均應用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立最佳稀釋倍數。1.加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37反應120分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加

6、檢測溶液A工作液100ul(在使用前一小時內配制,37,60分鐘。3.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干。4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液100ul,37,60分鐘。5.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干。6.依序每孔加底物溶液90ul,37避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止。7.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液

7、的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值。在加終止液后立即進行檢測。注:1.每次實驗留一孔作為空白調零孔(不同于空白孔,該孔不加任何試劑,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。2.嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫。使用后立即冷藏保存試劑。3.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體。為防止樣品蒸發,試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,酶標板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發;洗板后應盡快進行下步操作

8、,避免酶標板長時間處于干燥狀態。4.消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。5.在儲存和溫育時避免強光直接照射。6.未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用,請精確配置標準品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10ul,以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液A、B,以及底物溶液在使用前,應置于37溫育30分鐘;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。7.建議檢測樣品時均設雙孔測定,以保證檢測結果的準確性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁或甩掉酶標板內的液體;在實

9、驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,根據需要,重復此過程數次。自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性本試劑盒可同時檢測重組或天然的人CK-17,且與其它相關蛋白無交叉反應。計算以標準物的濃度為橫坐標(對數坐標,OD值為縱坐標(普通坐標,在半對數坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業制作曲線軟件進行分析,如curve expert1.3,根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,

10、即為樣品的實際濃度。注意事項1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。2.一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用多道移液器加樣。3.請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。4.如標本中待測物質含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請最后乘以稀釋倍數。5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。6.底物請避光保存。檢測范圍:0.312ng/ml-20ng/ml最低檢測限:0.078ng/mL說明1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本/標準品,酶結合物或底物時,第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的“預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結果。3.試劑盒保存:部分試劑保存于