1、地黃飲子對老年性癡呆模型大鼠的學習記憶及炎性反應的影響    作者：宋琳 安平 樸鐘源 謝寧 姚麗芬【摘要】  目的探討地黃飲子對AD模型大鼠的學習記憶及炎性反應的影響。方法模型組以D半乳糖腹腔注射合并A注射海馬制備AD動物模型，各治療組分別在造模的同時灌胃地黃飲子和抗腦衰膠囊、哈伯因。運用MORRIS水迷宮檢測各組大鼠的學習記憶能力及采用免疫組化方法觀察各組大鼠海馬神經元TNF，IL1蛋白的變化。結果治療組能縮短潛伏期、增加過臺次數，第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異，說明地黃飲子能改善癡呆大鼠空間探索記憶能力，低劑量組已經顯效，高劑

2、量組效果更為明顯。地黃飲子治療組IL1，TNF含量顯著下降，且具有劑量差別。結論 地黃飲子對癡呆模型大鼠學習記憶空間探索能力有改善作用及能有效抑制海馬神經元炎性反應，其作用機理可能與地黃飲子抑制海馬神經元TNF，IL1蛋白，抑制小膠質細胞活性進而減輕海馬神經元的炎癥損傷有關。【關鍵詞】  地黃飲子； 老年性癡呆； 淀粉樣蛋白； MORRIS水迷宮； 炎性反應Effect of Decoction of Rehmanniae on Improving Learning Memory Ability  and Inflammation Reaction of  Alz

3、heimers  Disease  Model  RatsAbstract：ObjectiveTo investigate effects of Decoction of Rehmanniae（DR） on improving learning  memory ability and inflammation reaction of Alzheimers disease(AD) model rats.MethodsAD model rats induced by D-galactose intraperitoneal injection and the

4、hippocampus injected -amyloid(A) were made. Every group was fed with Hup A, Kangnaoshuai and DR. The ability of learning memory was measured by Morris water maze(MWM). The inflammatory reaction of hippocampus neurons were observed by electron lens using immunohistochemistry method.Results DR could s

5、horten the escape latency and increase the number of passing plats and the swimming distance of the fourth quad compared with the other quads.  DR could dose-dependly reduce the expression of TNF，IL1 protein of Hippocampus neurons. ConclusionDR can improve the ability of spatial exploratory and

6、 effectively control the inflammation reaction. The mechanism of action is possibly relevant that DR can decrease the expression of IL1 and TNF to inhibit the activity of glia cell and inflammatory injury of hippocamus neurons.Key words：Decoction of Rehmanniae；  Senile Dementia；  amyloid ；

7、  Morris water maze；  Inflammation reaction老年性癡呆（Senile dementia）,亦稱阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD），是一種常見于老年人的神經退行性疾病。本實驗根據AD發病的淀粉樣蛋白（A）致病學說1制備AD復合動物模型，觀察地黃飲子對擬AD模型大鼠的學習記憶及炎性反應的影響，旨在探討本方防治AD的作用機理。1  器材1.1   動物  健康Wistar雄性大鼠140只，普通級，重（260±20）g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心（許可證編號:黑動字

8、第P0010200A號）提供。1.2  藥物與試劑  地黃飲子制備方法：醇、水提取液與揮發油提取液，離心、濃縮至適量。合并上述醇、水提液及揮發油制成含生藥1 g/ml的濃縮液。抗腦衰膠囊由石家莊四藥股份有限公司生產(國藥準字Z13021850，生產批號040107) ，配制成含生藥0.2403 g/ml水溶液。哈伯因由河南竹林眾生制藥股份有限公司生產(國藥準字H10940156，生產批號040103) ，配制成0.001 8/L水溶液。試劑：D半乳糖由上海華舜生物工程有限公司提供（批號707222）。A140，Sigma公司提供（Lot:088K49512）。TNF，IL1

9、免疫組化試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。pv6001/2二步法免疫組化試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。1.3  儀器腦立體定位儀（NARISHIGE SN-2型 日本）、MORRIS水迷宮系統（DMS2中國醫學科學院藥物研究所）、攝影顯微鏡（OLYMPUS日本）等。2   方法2.1  分組方法140只Wistar大鼠隨機分成7組：空白組、假損傷組、模型組、抗腦衰對照組、哈伯因對照組、中藥治療高、低劑量組，每組20只。2.2  模型制備2假損傷組腹腔注射生理鹽水，余組均給予D半乳糖（50 mg/kg·d）腹腔注射4周

10、，造成亞急性衰老；4周后在腦內注射凝聚態A1401，TNF蛋白表達檢測    行為學測試完畢，大鼠迅速處死取腦，固定，選取注射部位，修塊，再固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，采用免疫組化（PV二步法）檢測IL1，TNF蛋白表達，光鏡下觀察鼠腦海馬細胞蛋白表達。其中滴加一抗（均150比例稀釋），滴加二抗（均是山羊抗兔）工作液，陰性對照為一抗加PBS。2.5  數據處理數據采用±s表示，數據統計分析均在SPSS11.0軟件中進行，采用方差分析，多組間兩兩比較用LSD法。3  實驗結果3.1  地黃飲子對AD大鼠Mo

11、rris水迷宮行為學-空間探索實驗的影響結果見表12。表1  大鼠空間探索實驗結果（略）與空白組、假損傷組比較，P0.01；與模型組比較，*P0.05，*P0.01表2  大鼠空間探索試驗結果（略）與空白組、假損傷組比較，P0.01；與模型組比較，*P0.05，*P0.01；與西藥對照組比較，#P0.05；組內第四象限與其它象限比較，0P0.05，00P0.01結果表明，與空白組比較，模型組潛伏期延長、過臺次數減少，差異顯著（P0.01），表明模型鼠空間探索能力下降。給藥組中，治療組和對照組均能縮短潛伏期、增加過臺次數，與模型組相比具有明顯差異（P0.05或P0.01），說

12、明治療有效。各治療組和對照組第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異（P0.05），而模型組大鼠象限游泳距離差異無顯著性（P0.05）。表明正常組和各治療組大鼠對原平臺象限的記憶較模型組好。同時我們計算出各組大鼠在原平臺象限第四象限游泳的時間(t4)和距離(l4)與總游泳時間(總)即60 s和總距離(L總)之比(t4/t總，l4/L總)。經分析各治療、對照組與空白組t4/t總、l4/L總比較均有差異（P0.05或P0.01），中藥高劑量組大鼠與西藥對照組l4/L總比較有差異（P0.05），說明地黃飲子對癡呆大鼠有改善記憶作用，低劑量組已經顯效，高劑量組效果更為明顯，且優于西藥對照組。3.2&

13、#160; 地黃飲子對AD大鼠腦IL1，TNF蛋白的影響蛋白表達的判斷標準：海馬CA1區IL1蛋白陽性表達，胞核和胞漿均呈棕黃色細微顆粒狀。在海馬CA1區可見明顯的TNF陽性表達，胞體較小，呈卵圓形、梭形或三角形，胞漿濃染，突起較少，大多為小膠質細胞。實驗結果采用CMIAS多功能真彩色病理圖象分析系統進行分析，將圖像輸入計算機，計算陽性目標總面積與統計場總面積比值，取平均值進行統計分析。結果如表3及圖16 (200×) 所示。表3  各組大鼠海馬神經元IL1，TNF蛋白表達的影響（略）與空白組、假損傷組比較P0.01；與模型組比較，*P0.05,*P0.01;n=8結果顯示

14、，模型組IL1，TNF均呈強陽性表達，與空白組和假損傷組相比差異顯著（P0.01）。表明AD動物模型誘導腦組織IL1，TNF蛋白表達增強。經治療后各組IL1，TNF蛋白含量均顯著下降，其西藥對照組及高劑量組效果最為顯著（P0.01），低劑量、中藥對照組也顯示出良好的療效（P0.05），說明地黃飲子高劑量與哈伯因均能有效抑制海馬神經元升高的相關炎性蛋白表達，尤以地黃飲子效果最佳，且具有劑量差別。圖1  免疫組化ILI海馬空白組200×  （略）圖2  免疫組化ILI海馬模型組200×（略）圖3  免疫組化ILI海馬中藥高劑量組200&#

15、215;（略）圖4  免疫組化TNF海馬模型組200×（略）圖5  免疫組化TNF 海馬中藥高劑量組200× （略）圖6  免疫組化TNF海馬西藥對照組200×（略）4  討論現已發現AD發病早期，炎癥反應有利于A的清除，對神經有保護作用。但過度激活的小膠質細胞（特別是位于老年斑附近）能分泌細胞因子，主要有IL1，IL1，IL6，S100、TNF，IFN和一些早期補體成分等。可見神經膠質細胞及其產生的多種炎性產物介導了這一個病理損傷過程。在A刺激下，小膠質細胞產生IL1是始動環節，IL1除上調小膠質細胞或星形膠質細胞表達其它

16、細胞因子外，尚誘導補體、急性期蛋白、氧自由基、NO，APP等生成增加。這些分子各自通過作用于膠質細胞或神經元，促進其它炎性分子的產生，這種交互作用促進了慢性炎癥反應的形成和炎性產物水平持續升高，對神經生長與神經可塑性、損傷與變性及各種死亡機制產生廣泛的影響4。TNF-在炎癥反應中是激活細胞因子級聯反應的主要物質，它還可直接作用與星形膠質細胞和少突膠質細胞，導致髓鞘和少突膠質細胞的損傷，引起少突膠質細胞凋亡來發揮比TNF-更大細胞毒性作用5。本實驗中，地黃飲子治療組能縮短潛伏期、增加過臺次數，第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異，說明地黃飲子對癡呆大鼠有改善空間探索記憶作用，低劑量組已經顯

17、效，高劑量組效果更為明顯。地黃飲子高劑量組IL1，TNF含量顯著下降，說明地黃飲子能有效抑制海馬神經元升高的相關的炎癥蛋白表達，且具有劑量差別。我們在實驗中認識到6，7：A能誘導腦組織產生大量自由基，MDA含量明顯升高，降低 SOD，CAT和GSHPx活性，使Ca2+大量內流。地黃飲子可以通過調節抗氧化酶活性起間接抗氧化作用，提高CAT和GSHPx協同作用以使細胞內H2O2 濃度保持在穩定水平,緩解其毒性。因此我們推測，地黃飲子有效成分有可能通過消除自由基的產生，提高抗氧化酶活性，調節細胞膜通透性，保持鈣穩態的作用，來下調海馬神經元TNF，IL1蛋白表達，抑制小膠質細胞活性，減輕海馬神經元的炎

18、癥損傷，從而改善癡呆大鼠空間探索記憶能力。【參考文獻】1 Selkod DJ.Alzheimers disease: a central role for amyloidJ.Neuropathol Exp Neurol,1994,53：438.2 謝 寧，宋 琳，牛英才，等.地黃飲子對老年性癡呆模型鼠腦神經元細胞凋亡及超微結構的影響J.中國臨床康復，2005，10(7)：93.3 張魁華,賴世隆，王 奇，等.補腎益智方對老年性癡呆模型動物空間探索學習記憶功能的改善作用J.中草藥，2002，33（12）：1093.4 韋道祥,陳俊拋.小膠質細胞與阿爾茨海默病J.國外醫學·老年醫學分冊,2000，11：248.5 Velzaquez P,et al.Asparate residue i