1、文缺綜述國用腿雷涉門扇活裁伽哽苗的研拜迅展*II朱麟'，王紅寧2（1.四川農業大學動物科技學院，四川雅安625014；2.四川大學生命科學學院，四川大學動物疾病防控生物工程研究中心，四川成都610064）疫苗主要通過激發機體的免疫系統來達到防治疾病的目的。目前，疫苗主要有滅活疫苗、減毒疫苗及基因工程疫苗等。基因工程疫苗包括基因缺失苗、基因重組苗等。活載體疫苗是將胞內感染性的細菌直接用來運載目的基因進入體內，而產生相應的免疫應答反應。目前沙門菌的預防與治療通常使用藥物"但沙門疫苗研究正退速發展，如減毒沙門萌活載體疫苗則是將減毒后的沙門菌作為載體，運載編碼抗原的基因進入體內，激發

2、免疫反應。很多實驗證明，減毒菌能對與活載體相關細菌產生免疫保護力，又能對插入基因相關疾病產生保護力，有效激發機體產生免疫應答，同時不會對該細菌的生存與繁殖產生影響3氣減毒沙門菌可侵入到宿主的Peyer集結、腸淋巴結、肝、脾等組織細胞，表達異源抗原，不僅激發出宿主針對沙門菌本身的免疫反應，而且激發出針對其所攜帶抗原的各種免疫反應，包括局部體液免疫、全身體液免疫和細胞免疫反應，尤其是CTL作用，而減毒沙門曲本身可以起到免疫佐劑的作用。由于已減毒，最終可被宿主清除。減毒沙門菌作為載體運送目的基因進入體內，誘導機體產生黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答。在這一過程中既能保證載體疫苗的安全性，又能以誘導保

3、護性免疫應答的方式表達外源抗原。減毒沙門菌活載體疫苗可以攜帶較大的基因片段，易于構建多價疫苗，具有聯合免疫和免疫佐劑的作用，所表達的靶抗原不需要提純，能激起持久的系統和黏膜免疫反應，同時，還具有誘導作用位點比較明確、制備簡單、安全性好、批最生產成本低、接種簡單方便等優點，2成為疫苗領域的研究熱點。近年來有實驗表明，減毒沙門菌可將克隆有異源抗原基因的真核表達質粒攜帶并釋放入宿主深部淋巴細胞，使異源抗原基因在淋巴細胞的真核環境中進行表達。因此，減毒沙門菌既可作為針對同源抗原的活疫苗，也可作為誘導針對其他病原微生物產生保護性反應的載體。減毒沙門菌載體的構建策略是使致病基因缺失，然后將外源基因整合到沙

4、門菌染色體的特定部位，這樣沙門菌就可以穩定表達外源基因。異源抗原的表達目前主要采用帶抗性的質粒載體進行表達、利用染色體整合系統或構建平衡致死系統3種方法。沙門菌減毒株多為生物合成途徑缺陷或調節表達系統缺陷的突變株，如aro、phoP或bQ突變株。這些菌株可以模擬自然感染但不引發疾病，并有很好的耐受性和免疫原性,這就有助于我們構建減毒沙門菌活載體疫苗，呈遞外源抗原，預防各種病原體引起的疾病氣1國內外研究進展隨著分子生物學的應用和對沙門菌致病機制的進一步了解，人們能夠識別病原體在宿主體內生存和致病的一些必需基因，這些基因的缺損在遺傳上是穩定的，因此可以通過基因工程的手段使沙門菌達到的效果。1987

5、年Curtiss等構建了cya.crp雙基因突變株，因該菌缺失基因，不能合成cAMP受體蛋白，乂缺失cya基因，亦不能從宿主體內攝取cAMP以供己用，所以它在宿主體內返強的可能性很小。Curtiss研究組在1994年發展了一種asd/asd-平衡致死體系。該系統沙門萌染色體上md基因的缺失突變由質粒載體攜帶的以#來彌補。已將5上引入其他如aroycya、crp減毒株中用來表達肺炎球菌表面蛋白A(PspA)并有保護作用。wd基因編碼天冬氨酸B2半醛脫氫酶，突變后細菌的生長需要二氛基庚二酸(DAP)以合成細胞壁，而動物組織中沒有DAP,所以這種平衡致死體系保證細菌進入宿主后能穩定高效表達外源抗原o

6、Cuniss等1996年基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化對氨基苯甲酸和2,4-二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應，產生芳香族氨基酸皿。當耐。A基因缺失，該菌在無此合成途徑的哺乳動物體內，無法獲得這些化合物，生長受到限制從而被減毒。Fagan等于1997年用鼠傷寒桿萌SL3261(q”A)減毒株表達豬肺炎支原體抗原(NrdF)蛋白回。McSorley等在1997年研究認為nirB啟動子比osmC啟動子效率高。利用這兩類體內誘導型啟動子可以穩定地在體內表達外源抗原。Guo等在1997年通過質譜儀研究發現,PhoP/PhoQ蛋白也調節脂多糖(LPS)成分之一類脂A的結構修飾，

7、從而改變LPS刺激的宿主細胞細胞因子的表達皿。HeithofF等在200()年發現pAoP基因可激活多種基因表達，而phoP蛋白或pAoP調節基因的產物可在GATC位點封閉dm的甲基化，還有人認為phoP基因調節的一個基因可能編碼細菌在巨噬細胞中存活所必須的種分泌蛋白,phoP基因的突變會減弱鼠傷寒沙門菌在巨噬細胞中的存活力，Ty800、X4632、ZJ111都是缺失phoP/phoQ基因的突變株14oBumann等在2000年的研究中發現htrA突變株增強了對氧化應激的敏感性，從而削弱了它在宿主組織中生長的能力:。小鼠免疫實驗證明限定型htrA突變是極好的口服疫苗。在對人有副作用的減毒株CV

8、D908中引入htrA突變后，減毒株安全且保持免疫原性。Basso等于20(X)年篩選了傷寒桿菌細胞內誘導啟動子Pial、Pia2,構建了一系列表達載體在這些啟動子控制下，重組沙門菌侵入真核細胞后條件性表達外源抗原。該系統已在Henle407細胞中表達百口咳毒素S1亞單位重組抗原得以驗證。梁雪芽等2002年研究表明，基因編碼DNA腺苜酸甲基化酶，此酶調肯的基因在其啟動子或上游調節序列中都含有GATC位點，這些位點的甲基化可以控制RNA聚合酶和調節蛋白的相互作用S。此外,如基因還調節其他毒力相關基因的表達，并通過調節亮氛酸(leucine,Leu)反應調節蛋白和菌毛基因DNA序列的結合來控制菌毛

9、的表達。2003年張輝等將小d基因連接到相關質粒上導入asd突變株中，構成載體-宿主平衡致死系統，既保證了質粒的穩定又提供了細菌細胞壁合成所需的DAP,此系統因不含耐藥基因被廣泛的應用于臨床實驗中響。目前國內外學者對減毒沙門菌活載體疫苗應用方面的研究也越來越多。Hassan等于1996年研制出的MeganVacI疫苗就可以在食品安全控制方面加以應用，該疫苗是cya和erp基因突變的鼠傷寒沙門菌。家禽口服免疫MeganVacI疫苗后，可以特異性地降低沙門菌感染。用MeganVac1疫苗接種雞，產生了特異性針對B群和D群沙門菌的體液和細胞免疫應答，顯著降低了野生型菌株在雞體內的重新定殖，而且還可以

10、對其他血清型沙門菌感染產生交又保護。種雞群接種MeganVacI疫苗后，可產生持久的、具有保護性的母源抗體，這大大降低了沙門曲污染雞蛋的可能性。Jain等在2001年研究發現沙門菌載體可以用于腫瘤的基因治療，如表達IL-2,或用于運送抗腫痛治療藥物，如抗腫瘤前體藥物轉化酶用。由于沙門菌具有對實體瘤的自然趨向性，根據這一特性，利用鼠傷寒沙門菌VNP20009可運送藥物蛋白到腫瘤部位，臨床研究表明，腫瘤細胞在原位被選擇性殺死。鼠傷寒沙門菌VNP20009是pwl(負責嗦吟生物合成)和眥B(負責LPS生物合成)基因缺失株，因而毒力大為降低，其對小鼠的毒力較野生型菌株大約下降了10000倍。杜愛芳等在

11、2004年將雞柔嫩艾美耳球蟲5401基因的真核表達質粒pcDNA3-5401,高壓電轉化到ds和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門菌(ZJ111株)中，構建重組菌株，將其直接轉染Ver。細胞，證明了減毒沙門菌能將外源基因呈遞給Vero細胞并進行表達。通過雞體內試驗和體外培養表明，利用減毒沙門菌為載體傳遞DNA疫苗具有良好的安全性和穩定性。張曉明等在2005年利用場/A基因突變的沙門菌能破壞含沙門菌囊泡（SCV）的特性，利用P22噬菌體轉導技術將Sg基因的突變轉入疫苗株SL7207,成功地構建了沙門菌SL7207Sifh突變株。該突變株可以突破SCV的束縛而進入細胞液，并有望成為理想的沙門菌疫苗

12、載體。張小榮等于2006年根據GenBank中已發表的H5亞型禽流感病毒HA基因序列，設計一對引物，通過RT-PCR擴增鵝源H5亞型高致病力禽流感病毒HA基因，測序確認后，將其克隆入其核表達載體，將重組質粒轉染P815細胞，經間接免疫熒光試驗證實，HA基因在細胞內得到了瞬時表達。進一步將重組質粒轉化減毒鼠傷寒沙門菌X4550得到運送DNA疫苗的重組沙門菌，免疫BALB/c小鼠，不僅可以檢測到HA特異性的血清抗體應答，而且還能抵抗穩定表達H5亞型禽流感病毒HA基因的P815肥大細胞瘤的攻擊，說明該運送DNA疫苗的減毒沙門菌系統在體內能夠成功釋放所攜帶的質粒，并且能夠刺激機體產生保護性免疫應答。潘

13、志明等根據GenBank中發表的新城疫病毒融合蛋白（F）基因序列，設計一對引物，通過RT-PCR擴增出鵝源新城疫病毒分離株JS-5F基因，測序確認后，將其克隆入真核表達載體pVAXl,將pVAXl-F轉化減毒鼠傷寒沙門菌X4550,獲得運送DNA疫苗的重組沙門菌X4550（pVAXl-F）。免疫CD1小鼠，可以檢測到特異性針對NDVF蛋白的血清抗體應答，表明該運送DNA疫苗的減毒沙門菌系統在體內能夠成功釋放所攜帶的質粒，并能夠刺激機體產生免疫應答李龍等用長距離RT-PCR擴增了傳染性法囊病病毒ZJ2000株多聚蛋白基因，定向克隆入真核表達載體pCI,電轉化dam-pho?'雙突變的減毒

14、鼠傷寒沙門菌ZJ111株，并直接轉染Vero細胞。RT-PCR和間接免疫熒光試驗可從Vero細胞中檢測到陽性信號.SDS-PAGE和West-blotting均可檢測到41ku的蛋白條帶。結果表明減毒沙門菌可將外源基因導入Vero細胞，并進行轉錄和表達，具有免疫反應性。Sadoff等將伯瘧原蟲環子抱子蛋白基因克隆到含有入噬菌體啟動子的質粒pMG27NSTerm上，構建成重組質粒pMGB2,轉化aroA突變的鼠傷寒沙門菌WR4017株，灌胃接種BALB/c小鼠，灌胃接種的小鼠沒有測到特異性抗體，但是小鼠獲得抵抗子抱子攻擊的能力，可見灌胃接種的小鼠雖無體液介導的免疫反應，但有細胞介導的免疫反應。隨

15、后的體內淋巴細胞去除試驗和體外CTL作用測試顯示，上述的保護作用與MHCI限制的CD&CTL作用有關。目前國內外學者已相繼研制了肺炎鏈球菌、宋內志賀菌、結核分支桿菌、霍亂孤菌、百日咳桿菌、鼠疫耶爾森菌、牛布魯菌、破傷風梭菌、沙眼衣原體和豬肺炎支原體、甲乙丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、偽狂犬病病毒、流感病毒、血吸蟲、瘧原蟲以及腫瘤等疾病的重組減毒沙門菌疫苗。這些疫苗都能誘導機體產生黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答焦紅梅等根據GenBank公開序列設計一對引物，通過RT-PCR擴增出小鼠肝炎病毒的全長S1基因，并將其插入真和表達質粒pVAXl中，構建真核表達質粒pVAXl-

16、Sl,再將重組質粒轉染COS-7細胞，采用間接免疫熒光檢測出S1蛋白的外源表達。將重組質粒轉入減毒鼠傷寒沙門菌SL7207中，接種小鼠，結果顯示重組萌對小鼠有良好的安全性，并能檢測到針對S1蛋白的特異性血清抗體:&。2存在問題應用活載體疫苗也存在一定的局限性：第一，重組表型的穩定性，采用細菌菌株作為異源抗原的疫苗載體，質粒的應用常常引起重組表型的不穩定性，載體的競爭力、可重復性和效力都得不到保證。另外，在非限制狀態下菌株的傳遞存在抗生素抗性標志。第二，先存的免疫力，如果已對載體菌株有免疫力，則將顯著削弱所誘導的對異源抗原的免疫應答。第三，宿主遺傳因素，宿主遺傳因素可以調控由活菌載體本身

17、或其表達的疫苗抗原刺激的免疫應答。3展望減毒沙門菌不僅可以預防沙門菌的感染，而且還可以作為異源抗原的載體，構建表達其他病原體保護性抗原的活疫苗，通過口服和黏膜免疫獲得相應局部免疫、體液免疫和細胞免疫應答。這種活載體疫苗不僅使用方便，而且成本低廉，尤其適用于規模化養殖的群體免疫，在疫苗制備過程中避免向環境散毒的危險。但其存在的一些局限性仍有待我們進一步研究創新，為制備有效的疫苗提供理論基礎，參考文獻：1李郁，巍建忠.李超.等.同時感染雛格群的兩種血清型沙門做的鑒定及約敏試驗J.中國家禽，2008,30(4):45-46.2馮翠蘭，馮國金，龍建勇，等.中草藥消毒劑消推效果的初步研究UL中國家禽.2

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