1、.論著比色法與核磁共振法測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖氧乙酰基含量的比較袁菲，李阿妮，羅樹權,孔素娟，馬缽，王晶，李燕婷，劉方蕾蘭州生物制品研究所有限責任公司第-研究室甘肅省疫防工程技術研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的比較Hestrin比色法(簡禰比色法)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)法在檢測A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖氧乙酰基(O-Acetyl,OAc)含量的相關性和精密度。方法用比色法和NMR法測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群英膜多糖水解物的OAc含fit,比較分析兩種方法的

2、相關性及精密度。結果兩種方法檢測A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量的決定系數分別為尸N0.954&N0.960、正N0.969、中no.972；比色法檢測3批C群腦膜炎球菌莢膜多糖(PSC)OAc含蛾的精密度，SO值分別為0.21,0.21,0.18,對應CV值分別為9.03%,9.01%、8.70%(95%置信區間);NMR法檢測3批A群腦膜炎球菌莢膜多糖(PSA)OAc含量的精密度,SD值分別為0.66.0.78、0.83,對應CV值分別為0.72%、0.85%、0.93%(95%置信區間)；結論比色法和NMR法在檢測A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含

3、量方面相關性良好，精密度良好.核磁法較比色法精密度更高°關鍵詞：A、C、Y、W135群腦膜炎奈瑟曲;氧乙酰基含雖;核磁共振法；比色法中圖分類號：R378文獻標志碼：A文章編號：1005-5673(2017)06-0013-09DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.003ComparisonofHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalysisofO-acetylcontentofgroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalcapsularpolysaccharidesYUANFei,UA-ni,L

4、UOShu-quan,KONGSu-juan,MAYu,WANGJing,UYan-ting,LIUFang-leiFirstDepartmentofResearch,IxinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,lid.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:LIUFang-lei,E-mail:lflei30Abstract:ObjectiveTocomparetheHestrincol

5、orimetricandNMR(nuclearmagneticresonance,NMR)methodsinanalysisoftheO-acetyl(OAc)contentfbrthegroupsA,C,YandW135Neisseriameningococcalcapsularpolysaccharides(PSC).MethodsTousetheHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalyzingtheOAccontentofthegroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCandtheir*sderivativ

6、esandOAccontentfromhydrolyzedPSCingroupsYandW135.Theconsistencyandprecisionwerecomparedbetweenthetwomethods.ResultsThecorrelationcoefficientR*N0.954,0.960,0.972,0.969wereobnUiinetlbyusingbothmethods.TheinternalSDwere0.21,0.21,0.18andCVwerc9.03%,9.01%,8.75%(95%Cl).respectively,indeterminationOAcconte

7、ntfrom3lotsPSCbyHestrincolorimetricmethod；andtheinternalSDwere0.66,0.78and0.83,andtheCVwere0.72%,0.85%and0.93%byNMRincorrespondence.ConclusionThegoodcorrelationandprecisionwereobtainedinanalyzinggroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCbyusingofHestrincolorimetricandNMRmethods,andthelaterhadanbett

8、erprecision.Keywords：GroupsA,C,Y,W135Neisseriameningitides；O-Acetylcontent；Nuclearmagneticresonance(NMR)；Hestrincolorimetricmethod基金項目：國家科技重大新藥創制專項(20I3ZX09402-302-215)作者簡介：袁菲(1982-),女，醫學生物學工程師，主要從事細菌性多糖蛋白結合疫苗的研發工作。通信作者：劉方蕾，研究員,E-mail：lflei30腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)(以下簡稱腦膜炎球菌)是腦膜炎(meningitis)和腦

9、膜炎球菌血癥(meningococcemia)等侵襲性細菌感染的主要致病菌。莢膜多糖是腦膜炎球菌一種重要的毒力因子，其生物組分不同，可分為13個血清型，A、B、C、W135、X和Y是主要的致病血清型。其中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖的C-3位和C-4位;C群莢膜多糖的C-7位和C-8位;Y群莢膜多糖的C-7位和C-9位以及W135群莢膜多糖的C-7位和C-9位均存在氧乙酰化修飾，見表1。氧乙酰基（O-Acetyl,OAc）是腦膜炎球菌莢膜多糖上的重要功能基團，但其化學性質不穩定，在結合物的制備過程中容易丟失。A群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc去除后導致多糖的免疫原性降低。OAc含量是腦膜炎球菌多搪疫苗和

10、多糖蛋白結合疫苗生產過程中十分重要的質控指標,WHO和歐洲藥典均對其提出了明確的質控要求質6】。表1腦膜炎球菌英膜多糖重復單位結構Tab.1StructureoftherepeatunitsofCPSsfromthefourgroupsofmeningococcalpolysaccharidesfourmeningococcal莢膜多糖血清型結構A*6)-a-D-ManpNAc-(1-PO4-*13,4OAcC-2-a-I)-NeupNAc-9-»|7,8OAcY-6)-a-Glcp-(1-*4)-a-NeupNAc-(2|7,9OAcW135-*6)-a-(>alp-(l-*

11、4)-a-NeupNAc-(2-#|7,9OAcllestrin比色法（簡稱比色法）和核磁共振（rmbearmagneticresonance,NMR）法是目前運用最廣泛的兩種測定OAc含量的方法。中華人民共和國藥典2015版（三部）（簡稱中國藥典）推薦使用比色法，歐洲藥典等也仍沿用傳統的比色法計算OAc含量。近年來，NMR法的發展在鑒別細菌多糖結構和純度、指導細菌多糖疫苗及多糖蛋白結合疫苗的質量提升方面做出了極大的貢獻,WHO相關指導原則要求各監管機構盡可能采用NMK法進行多糖質雖的分析質控。重要的是，比色法只能計算OAc總含員，而NMR法卻能區分不同位置上的氧乙酰化修飾情況。本研究采用比色

12、法和NMR法測定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群莢膜多糖水解物的OAc含量，進行相關性分析，并對兩種方法的精密度等進行了比較,現將結果報告如下。1材料與方法1.1樣品A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖由蘭州生物制品研究所有限責任公司菌苗一室提供；A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物，Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖水解物均由蘭州生物制品研究所有限責任公司第一研究室提供。具體批號見表2。1.2主要試劑及儀器氯化乙酰膽堿、鹽酸羥胺、鹽酸、酷酸鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉，均購自國藥集團化學試劑有限公司。UV.2550紫外分光光度計購自日本島津公司；B

13、ruker600MHz核磁共振譜儀購自瑞士Bruker（布魯克）有限公司；ScientificVORTEXGENIE振蕩器購自美國SI公司。1.3溶液的配制2mol/L鹽酸羥胺溶液：稱取鹽酸羥胺13.9g,加水溶解并稀釋至100mL,28Y保存;3.5mol/L氫氧化鈉溶液:稱取氫氧化鈉14.0g,加水使溶解并稀釋至100mL；4mol/L鹽酸溶液:量取鹽酸33.3mL,加水稀釋至100mL；0.37mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液：稱取三氯化鐵（FeCl3-6H,0）10.0g,加0.1mol/L鹽酸溶液溶解稀釋至100mL；堿性羥胺溶液：量取等體積的鹽酸羥胺溶液（2mol/L）和氫氧化鈉溶液（

14、3.5mol/L）混合,3h內使用。1.4 供試品的制備14.1對照品溶液的制備稱取已干燥至恒亞的氯化乙酰膽堿22.7mg,置50mL容量瓶中，加0.001mol/L醋酸鈉溶液（pH4.5）溶解并稀釋至50mL,搖勻。1.4.2樣品溶液的制備取各樣品,用水稀釋成OAc濃度為0.52.5mmol/L的溶液，OAc含量的檢測1.5.1NMR法參照文獻7J檢測供試品OAc含量，檢測溫度為298K（25T）,選擇的脈沖程序為zgo具體參數設置如下:采樣點數為64k,圖譜寬度為8012Hz,采樣時間為4.089s,弛豫延遲時間（叫）為57、掃描次數（NS）N64。信號經傅里葉轉換后加入0.3Hz的窗口函

15、數，最后使用Topspin3.0軟件處理結果。0】值采用67倍的7；值,PSA的1）,值設定為18,PSC、PSY和PSW的0值為20,NS值設置為128次。1.5.2比色法參照中國藥典，進行OAc含鼠的測定。1.6方法驗證1.6.1比色法和NMR法相關性用比色法兩次檢測的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量結果為X,NMR法兩次檢測的OAc結果為V,計算各樣本的均值（*和Yt）、樣本重復測定值間差值的絕對值和D,）及兩種方法測定結果均值間的差值（r-x.）。計算樣本重復測定值間差值（七,和DQ的平均數和兩種方法測定結果均值間差值（K-X）的平均數，超出上述平均數4倍時，為離群值

16、，應予刪除。以匕對X,作散點圖，以（E-M）對R作偏差圖，得到每個結果的散點圖和偏差圖，同時計算兩種方法的線性回歸方程。估算各樣品的預期偏差、相對偏差和預期偏差95%的置信區間。當估計誤差大于預期偏差置信區間的上限或小于預期偏差置信區間下限時，差異較大，偏差不能被接受；當估計誤差位于預期偏差置信區間上限與下限之間時，差異相當，偏差可以接受。1.6.2精密度對3批C群莢膜多糖HP20I505002.HP201505003.HP201505004用比色法重復檢測OAc7次，對3批A群莢膜多糖PSA試HP201506001、PSA-試HP201604001、PSA-試HP20101101用NMR法重

17、復檢測OAc12次,計算檢測結果的平均值、標準偏差（SO）及變異系數（CV）02結果2.1比色法和NMR法檢測OAc含量結果的相關性分析兩種方法檢測A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量:決定系數分別為R2N0.954、必no.960、足no.969、&2no.972,見表36和圖14。兩種方法在各型莢膜多糖檢測OAc含量時，估計誤差位于預期偏差置信區間上下限之間，偏差均可接受，見表7。2.2精密度2.2.1比色法的精密度3批PSCOAc含量的精密度檢測,SD值分別為0.21A21.0.18,對應的CV值分別為9.03%、9.01%、8.70%,3批批次CV值均<10

18、.00%，見表8。2.2.2NMR的精密度3批PSAOAc含量的精密度檢測,SD值分別為0.66、0.78.0.83,對應的CV值分別為0.72%、0.85%、0.93%,3批批次CV值均<1.00%，見表9。表2A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、衍生物及水解物批號Tab.2Thelotofcapsularpolysacharide,itsderivativesandhydrolysedproductfromGroupA,C,Y,W135Neisseriameningitidis血清型樣品批號A群多糖PSA-200807005；PSA-201011001；PSA-20130500

19、3；PSA-201506001；PSA-201604001；PSA-201609002；PSA-201612001多糖衍生物PSA-DAB201603001；PSA-DAB201603002；PSA-DAB201605003；PSA-DAB201605004；PSA-DAB201609014-201609018；PSA-DAB20170300I；PSA-DAB201703002C群多糖PSC-201604001；PSC-2016U001多慵衍生物PSC-DAB201509005,4FF純化；PSC-DAB201603001；PSC-DAB201603001,4FF純化；PSC-DAB20160

20、3002-006；PSC-DAB201605007；PSC-DAB201605007.還原后；PSC-DAB201703001W135群多糖PSW-精20100504；PSW-201602001多糖衍生物PSW-DAB201508006；PSW-DAB201603001；PSW-DAB201603001,4FF純化；PSW-DAB201603002-201603002005；PSW-DAB201604005,4FF純化；PSW-DAB201604006Y群多糖水解物PSW-hydro201603005-201604008多糖Y-試P201602001多糖衍生物Y-DAB-試HD-2016030

21、01-HD-201603009；Y-DAB-試HD-201603001,4FF純化；Y-DAB-試HD-201604010；Y-DAB-試HD-201604010,4FF純化；Y-DAB-試HD-201604010,4FF再純化多糖水解物Y-hydrolysate試HH201604008；Y-hydrolysate-試HH201604009表3用兩種方法分別檢測A群莢膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.3ThedetectedcontentofOAcforcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupAbycolori

22、metricandNMRmethodsA群多糖批號比色法檢測OAc(mmol/g)NMR法檢測0Ac(mol/mol)匕匕2YX,XPSA-2008070052.382.3990.1591.070.010.9288.23PSA-2010110012.012.0384.6084.670.020.0782.62PSA-2013050032.622.8693.7594.000.240.2591.14PSA-2015060012.552.8292.7092.970.270.2790.15PSA-2016040012.302.3988.9589.400.090.4586.83PSA-2016090022

23、.162.3486.8586.960.180.1184.66PSA-2016120012.222.3487.7587.870.120.1285.53PSA-DAB2016030012.372.6590.0090.010.280.0187.50PSA-DAB2016030022.612.8693.6093.720.250.1290.93PSA-DAB2016050032.242.4088.0588.520.160.4785.97PSA-DAB2016050042.152.3686.7087.380.210.6884.79PSA-DAB2016090142.382.5690.1590.660.18

24、0.5187.94PSA-DAB20I6090152.242.4788.0588.400.230.3585.87PSA-DAB2016090162.202.2287.4587.550.020.185.29PSA-DAB2016090172.232.3287.9088.340.090.4485.85PSA-DAB2016090182.412.6090.6091.150.190.5588.37PSA-DAB2017030012.482.7891.6592.270.300.6289.33PSA-DAB2017030022.332.4389.4090.390.100.9987.52908812.448

25、x+59.566/r=0.954841.92.12.3比色法測定OAc含罐(mmol/g)圖1用兩種方法檢測A群莢膜多糖相關性Fig.1CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupAbycolorimetricandNMRmethods表4用兩種方法分別檢測C群莢膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.4ThedetectedcontentofcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupCbycolorimetricandNMRmethods比色法檢測OAc(

26、mmol/g)NMR法檢測OAc(mol/mol)C群多糖批號0、Dfx.x2Y,Y2PSC-2016040012.342.3780.7981.680.030.8978.88PSC-2016110012.572.8984.2484.560.320.3281.67PSC-DAB201509005,4FF純化2.642.9085.2985.830.260.5482.79PSC-DAB2O16O3OO12.832.9388.1488.980.100.8485.68PSC-DAB201603001,4FF純化3.083.3991.8991.910.310.0288.67PSC-DAB201603002

27、2.332.5480.6481.220.210.5878.50PSC-DAB2016030032.302.3480.1980.330.040.1477.94PSC-DAB2016040042.362.4181.0982.050.050.9679.19PSC-DAB2016040052.042.2576.2977.070.210.7874.54PSC-DAB2016040062.462.5082.5982.860.040.2780.25PSC-DAB2016050072.302.5980.1980.960.290.7778.13PSC-DAB201605007，還原后2.392.6881.548

28、1.920.290.3879.20PSC-DAB2017030012.292.4080.0480.720.110.6878.049590(一ouvlolussz(一ouvlolussz502.2y=13.408X+4B.7UR?=0.9602.42.62.8比色法測定OAc含ft(mmol/g)3.03.23.4圖2用兩種方法檢測C群莢膜多糖相關性Fig.2CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupCbycolorimetricandNMRmethods表6用兩種方法分別檢測Y群英膜多糖及其衍生物，水解物的OAc含量Tab.6Th

29、edetectedcontentsforcapsularpolysaccharides,O-acetyl,anditsderivativefrommeningococcalGroupYbycolorimetricandNMRmethodsY群多糖批號比色法檢測OAc(mmol/g)NMR法檢測0Ac(mol/mol)匕y20,D,YEY-試HP2016020010.790.9031.9032.210.120.3131.21Y-hydrolysate試HH2OI6O4OO80.700.7830.5530.770.090.2229.92Y-hydrolysate-試HH20I6040090.690

30、.8730.4730.590.180.1229.75Y-DAB-試HD-2O16O3OO10.770.8431.6131.740.070.1330.87Y-DAB-試HD-201603001,4FF純化0.760.9331.5431.930.170.3930.89Y-DAB-試HD-2O16O3OO20.780.8831.8832.310.010.4331.26Y-DAB-試HD-2O16O3OO30.770.8831.6131.730.110.1230.85Y-DAB-試HD-2016030040.600.7429.0629.100.140.0428.41Y-DAB-試HD-20160300

31、50.590.7328.9729.290.140.3228.47Y-DAB-試HD-2016030061.051.0835.8736.J20.030.2534.93Y-DAB-試HD-2016030071.011.1235.2735.430.110.1634.29Y-DAB-試HD-2016030090.910.9933.8034.240.080.4433.07Y-DAB-試HD-2016040100.670.7530.2030.450.080.2529.61Y-DAB-試HD-201604010,4FF純化0.600.6629.1229.260.060.1428.56Y-DAB-試HD-20

32、1604010,4FF再純化0.600.6129.1229.370.010.2528.6437y=15.129x+19395/?2=0.97235333129271.01.01.20.40.60.8比色法測定OAc含tt(mmol/g)圖4用兩種方法檢測Y群多糖相關性Fig.4CorrelationofO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupYbycolorimetricandNMRmethods表7A、C、W135、Y群莢膜多糖OAc含量檢測結果偏差分析Tab.7VarianceanalysisofO-acetyl

33、contentincapsularpolysaccharidefromthefourmeninicocalgroups英膜多糖血清型預期值預期偏差相對偏差（%）A89.200.670.70C80.200.600.74W13526.500.291.10Y28.500.702.30表8比色法檢測3批C群莢膜多糖OAc含量的精密度Tab.8TheprecisionfordetectedO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupCbycolorimetricmethod測定次數3批PSCOAc含量的精密度（mmol/g）PSC

34、試HP201505003PSC試HP201505002PSC試HP20150500411.932.311.7922.252.121.9232.152.062.2742.291.992.1452.232.561.8762.522.462.2672.592.442.00均值2.282.282.04SD0.210.210.18CV(%)9.039.018.70表9NMR法檢測3批A群莢膜多糖OAc含量的精密度Tab.9TheprecisionofdetectedO-acetylcontentfromcapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupAbyNMR測定次

35、數3批PSAOAc含量的精密度（mmol/mol）PSA試HP201506001PSA-試HP201604001PSA-試HP20101101192.0292.0186.88291.8291.9289.38390.9491.0189.35491.3990.3788.86590.7592.7287.91691.4990.5489.21792.6790.6688.89892.2091.8188.37992.1492.7988.321092.6990.9689.161192.0191.4188.521293.0091.1386.93均值91.9391.4488.48SD0.660.780.83CV(

36、%)0.720.850.933討論比色法作為檢測細菌莢膜多糖OAc含髭的經典方法，經過廣泛的運用，其檢測限、線性范圍、準確度、精密度、穩定性等均得到廣泛的驗證，但此方法只能計算OAc總含量，而不能區分不同位置上的氧乙酰化修飾情況。隨著疫苗可控性不斷提升，需要提供多糖結構的詳細信息,NMR檢測技術的發展和運用是一種發展趨勢，同時WHO已認可NMR檢測方法，并推薦其應用于多糖或多糖蛋白結合疫苗的生產和質量控制中。從研究結果來看，在嚴格控制各種標準試驗條件基礎上，比色法和NMR法在檢測A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖OAc含量方面均有良好的相關性，估計誤差位于預期偏差置信區間的上下限之間，偏

37、差均可接受。比色法檢測PSCOAc含最的精密度，S。值分別為0.21、0.21.0.18,對應CV值分別為9.03%、9.01%、8.70%；NMR法檢測PSAOAc含量的精密度,SZ)值分別為0.66、0.79、0.83,對應CV值分別為0.72%、0.85%.0.93%；表明使用兩種方法檢測OAc含量的精密度均為良好。NMR檢測OAc含量隸屬定量核磁共振(quantitativenuclearmagneticresonance,qNMR)中相對含量檢測范疇。它的檢測條件參數設置非常嚴格，如D,就是其中最重要的參數之一,qNMR檢測時必須5烏才能保證99.3%-99.9%的激發態的原子核回到

38、平衡態，只有這樣才能確保積分面積與質子數成正比，從而保證定量的準確性;不同的化合物T.值是不同的，且其值受環境溫度、樣品濃度、離子強度等因素的影響;另一個重要參數是NS,它和Di值不同，直接對qNMR的精密度產生影響。除以上所列的參數外，還有其他一些重要參數也值得關注，如采樣時間、脈沖序列、激發角度、窗口函數選擇等，它們也都對定量的準確性和精密度有一定程度的影響。最重要的是，不同實驗室對NMR檢測結果所采取的計算標準差異較大。因此，迫切需要對NMR法進行方法學的標準化并進行廣泛驗證，使其檢測結果具有可比性。比色法測定OAc的標線范圍是0.02.5mmol/g,最準確的樣品測定范圍僅是1.01.5mmol/g,而NMR定量測定時信噪比達到500:1,信號和噪音可完全區分